342微生物制药新药产生菌的分离.pptVIP

第二章 微生物制药 * 一、微生物药物的几个相关基本概念 二、微生物药物的分类 三、微生物药物的应用 四、药源微生物及微生物药物的筛选技术 五、微生物药物的发酵生产技术 六、微生物药物的分离、精制和鉴别 七、废弃物的综合利用和环境保护 四、药源微生物及微生物药物的筛选技术 （一）药物的产生菌 （二）新药产生菌的分离 （三）新微生物药物的筛选 （四）微生物药物产生菌的菌种改良 （五）微生物药物产生菌的保藏 （二）新药产生菌的分离 1、土壤微生物的分离 土壤是微生物的重要栖息地。 （1）采集样品 （2）分离微生物 （3）选留菌种及保存 分离放线菌的样品除土壤以外，还有河（湖、海）泥和水、枯树叶、堆肥、动物粪便等。 土壤样品通常采表层土（5cm以下），样品以未开垦过的土壤为佳，要尽可能选择不同地理和生态环境的土壤。 1、土壤微生物的分离 （1）采集样品 （2）分离微生物 （3）选留菌种及保存 样品的处理 分离培养基 抑制剂的使用 分离方法 培养条件 稀有放线菌的选择性分离 其他微生物的分离 利用放线菌孢子和细菌营养细胞及不同属间放线菌孢子间的耐性差异，用物理或化学的方法除去细菌及目的外放线菌，或者用花粉作为诱饵，增加某些特定放线菌的分出率。 马杜拉放线菌、小双孢菌，小四孢菌，孢囊链霉菌 土壤 100～120℃干热，1 h 马杜拉放线菌 土壤 100℃干热，15 min 高温放线菌 土壤 55℃干热，10 d 小单孢菌、链霉菌、红球菌、嗜酸放线菌和嗜碱放线菌等 水、土壤、粪便 55℃，6 min 链霉菌 土壤、植物根 40℃，2～16 h 分离的放线菌 样品 处理条件 分离前样品加热处理 样品的处理 A）温度 B）化学试剂的处理 SDS-酵母膏处理法，SDS对放线菌孢子基本无害，酵母浸膏以及温和的热休克可以促进放线菌孢子的出芽，使细菌数明显减少。 风干的土壤与CaCO3混合后在26℃培养7～9 d，然后分离放线菌。风干的土壤减少了细菌的数量，CaCO3有利于放线菌生长而不利于绝大多数真菌的生长。 用0.01 mol/L NaOH处理土壤5～10 min（15℃）可减少细菌的数量，有利于分离小单孢菌。 用1.4%酚处理土样10 min或用1.4%酚130℃处理30 min，分别有利于获得链霉菌或小单孢菌。 用乙酸乙酯或氯仿和苯处理样品，过滤风干后用来分离微生物，可以除去样品中的真菌。 C）物理方法的处理 离心，1600 g离心20 min，上清液主要有放线菌孢子，沉淀含有细菌和真菌孢子。 超声波处理，分离小单孢菌和链霉菌。 特殊器具捕集空气中的游离孢子，分离糖多孢菌。 搅动，使干草上孢子脱落，用于从干草中分离高温放线菌。 膜过滤，将水经膜（孔径0.45滤膜）过滤，浓缩水中微生物，再将膜直接贴在琼脂平板上培养。 诱饵法，在培养基中添加特殊物质，如花粉、蛇皮、头发等，可分离小瓶菌和发仙菌。 分离培养基 合成培养基——精氨酸培养基，高氏合成一号培养基，天门冬素培养基，察氏培养基等 有机培养基——Waksman培养基，Bennett培养基 几丁质培养基——只有放线菌能够利用几丁质，生长的菌落小，白色，需转接到产可溶性色素的适当培养基上加以区分 HV培养基——以土壤腐殖质为唯一碳源和氮源的培养基 总的要求：尽量使样品中的全部放线菌都生长出来，而其他微生物（细菌和真菌）又尽可能不长。 胶体几丁质，微量盐 各种菌属 葡萄糖，L-天冬胺酰，微量盐（NH2），维生素，土壤浸出液 链孢囊菌属 半浓度营养琼脂 嗜高温放线菌属 微量盐，丙酸钠，硫胺素（M3培养基） 诺卡菌属 下层：葡萄糖，L-天冬酰胺，微量盐 上层：（水解）酪蛋白氨基酸 小四孢菌属 微量盐，丙酸钠，硫胺素（M3培养基） 小单孢菌属 AV培养基 小双孢菌属 葡萄糖，甘油，L-天冬酰胺，微量盐，维生素（AV培养基） 马杜拉放线菌属 所用固体培养基中的主要成分 待分离的放线菌 选择性分离放线菌所使用的培养基 抑制剂的使用 加入抗真菌试剂（制霉菌素、两性霉素B、放线菌酮、丙酸钠以及使真菌形成较小菌落的rose bengal等），抑制真菌生长； 加入抗细菌抗生素（青霉素、链霉素）抑制细菌生长，增加放线菌的分出率； 加入某些抗生素也可抑制部分放线菌，有利于分离到一定种类的放线菌。如新生霉素有利于分离北里孢菌属。 分离方法 稀释法 干土喷射法 孢子飞扬法 滤膜法 ——最常用，将土壤样品用无菌水（或生理盐水、磷酸缓冲液）制成悬液，倍比稀释，涂布平板，恒温培养。 ——用喷土机或其他方法将风干碾细的土样直接喷在分离平板上。 ——将0.22~0.45μm的滤膜放在分离平板上，接种菌悬液或喷撒干土，适温培养一段时间，放线菌菌丝可穿过滤膜小孔生长到培养基上，细菌只能在滤膜表面生长，去掉滤膜，深入培养基的