第2章 DNA的结构.ppt

* * * * * * * * * * Watson-Crick的DNA双螺旋结构模型是根据DNA纤维的 X射线衍射分析建立起来的，得到的是双螺旋结构的平均信息，从而归结出DNA结构的规整性。到了70年代末，化学合成技术的改进使人们能够合成具确定序列的DNA片段，并使之形成单晶。 这种合成DNA晶体的X射线衍射揭示，DNA双螺旋实际上不是完全均匀的，即双螺旋的许多结构参数是随碱基序列的不同而在一定范围内变化的，这称为DNA的局部构象 A.依赖于序列的B-DNA构象变化 第二节 化学组成及结构 B.连续AT序列的构象变化 现已发现，DNA与一些蛋白质因子的结合部位是弯曲的。这种弯曲是连续A残基产生的，至少需要3个连续的A，最佳状况为5bp 染色体中的组蛋白为了结合到DNA上，面向蛋白质的DNA沟变窄，而另一面则扩大 这种变化是和其所含的一些短序列有关。在DNA的小沟朝内的部位常含2-3个连续的AT碱基对，而大沟朝内处常含有2-3个连续的GC碱基对 第二节 化学组成及结构 C.含错配碱基对的B-DNA 含GT，AC和GA碱基对的寡聚核苷酸的晶体分析说明，这些错配的碱基对都能包容在B-DNA双螺旋中，它们的构象参数一般处于允许范围内。每一错配碱基（除了一种GA配对外）都形成两个氢键，并且它们的宽度也都在 Watson-Crick碱基配对宽度的0.05 nm范围内 第二节 化学组成及结构 D.DNA的局部构象与DNA结合蛋白* DNA的局部构象是有其功能上的意义的，它们常是DNA-结合蛋白结合的标志 DNA结合蛋白泛指一类能结合于DNA的蛋白质，它包括各种酶（如DNA聚合酶、RNA聚合酶等）和调节蛋白（如CAP，Cro阻遏物等）。这些蛋白质与DNA的结合涉及到生物学中的一些基本问题，如遗传和个体发育等，因此，核酸-蛋白质交互作用已成为分子生物学中的一个研究热点 第二节 化学组成及结构 DNA和蛋白质的结合实质上是一个双向过程，DNA的局部构象既提供了识别标志和发生交互作用的结构条件，而蛋白质的结合又促使该处DNA的构象发生进一步的变化和使交互作用深化 如大肠杆菌的调节蛋白 CAP对乳糖操纵子启动子的结合即导致该DNA区段产生更多的折叠。核小体中DNA与组蛋白和限制性内切酶EcoRI与DNA上识别位点所形成的复合物的Ｘ射线结晶学分析就为这种相互关系提供了更为直接的证据 第二节 化学组成及结构 限制性内切酶EcoRI是含两个相同亚基的二聚体。它结合于DNA的识别位点上。其限制性片段如下： 如有Mg2+存在，酶就在特定位点切割DNA，故EcoRI-DNA复合物是在无Mg2+条件下分离得到的。衍射分析结果表明， EcoRI的两个亚基紧紧包裹着DNA双螺旋，它与大沟中的碱基契合而与小沟无接触、在复合物中，DNA的构象不同于经典的A型和B型；变形集中于三个突然出现的扭结中，后者又把各自3bp的4组核苷酸分隔开 第二节 化学组成及结构 DNA变性（概念、性质和Tm） DNA复性（含义与应用） 第三节 特性（变性与复性） I.DNA变性 指当双螺旋DNA加热至生理温度以上（接近100oC）时，它就失去生理活性。这时DNA双股链间的氢键断裂，最后双股链完全分开并成为无规则线团的过程。简而言之，就是DNA从双链变成单链的过程 变性（Denaturation）: DNA双链的氢键断裂，最后完全变成单链的过程称为变性 第三节 变性与复性 增色效应：它是指在DNA的变性过程中，它在 260 nm的吸收值先是缓慢上升，到达某一温度后即骤然上升的效应（见下图） 温度 相对吸收值 DNA解链 第三节 变性与复性 融解温度（Melting temperature Tm ) Tm： 是指变性过程紫外线吸收值增加的中点 生理条件下为85-95℃ 影响因素： DNA序列中G + C的含量或比例含量越高，Tm值也越大（决定性因素） 溶液的离子强度影响DNA的稳定性 某些化学物质如甲酰胺和尿素等,这是由于甲酰胺等会增加碱基在水中的溶解度，从而减弱碱基的疏水交互作用 溶液pH值 当溶液的pH接近12时，DNA碱基的酮基会转变成烯醇基；当pH接近2～3时，碱基上的氨基即质子化，pH的这些变化都会影响碱基间的氢键的稳定性从而改变Tm 第三节 变性与复性 II.DNA复性* 它是指热变性的DNA如缓慢冷却，已分开的互补链又可能重新缔合成双螺旋的过程。复性的速度与DNA的浓度有关，因为两互补序列间的配对决定于它们碰撞频率 复性（Renaturation）: 热变性的DNA缓慢冷却，单链恢复成双链 减色效应（Hypochromatic Effect）: 随着DNA的复性，2