3感受态细胞的制备与重组子的筛选-王汇编.ppt

感受态细胞的制备和转化及重组质粒的筛选 1、掌握大肠杆菌感受态的制备及转化的原理 2、熟悉实验的操作具体步骤 3、掌握蓝白斑筛选重组质粒转化的原理 实验目的 实验原理与方法 冷CaCl2转化原理： 感受态：细胞处于能够摄取外源DNA的状态称感受态，处于感受态的细胞称作感受态细胞。 受体细胞处于0℃、CaCl2低渗溶液处理后，细胞膨胀呈球形，细胞膜的通透性发生改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞( Competent cells )，外源DNA吸附于细胞表面，经42 ℃短时间热击处理，促使细胞吸附DNA复合物。 冷CaCl2转化过程： 转化（transformation）是质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。 （1）吸附 双链DNA吸附于受体菌表面。 （2）转入 双链DNA分子进入菌内。 （3）自稳 外源质粒DNA分子在细胞内复制成双链。 （4）表达 体外基因随同复制子同时复制，分裂，转录翻译。 体外连接的重组DNA分子导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、增值和表达。 操作步骤 1）感受态细胞的制备(CaCl2法) 从LB平板上挑取新活化的E.coli单菌落。接种于3-5ml LB液体培养集中，37℃下振荡培养12h左右，直至对数生长后期； 再将该菌悬液以1：100的比例接种于LB液体培养基中，37 ℃振荡培养至OD600 达