荧光定量PCR技术讲座0515.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * 逆转录 逆转录引物选择 下游应用：是否检测其它基因？ Abundant RNA的干扰：mRNA or total RNA？ 检测灵敏度是否足够？ 是否会有二级结构干扰？ 一步法还是两步法？ 两步法： 步骤多但灵活多样。cDNA可长期保留检 测多个基因。便于反应优化。 推荐：工作的初期阶段 RealSYBR 二步法荧光定量PCR试剂盒/With ROX RealSYBR 一步法荧光定量PCR试剂盒/With ROX RealSuper 二步法荧光定量PCR试剂盒/With ROX 一步法：简便、快捷但只做一个基因，一旦失败 难以查找原因。 推荐：工作的成熟阶段 RealSuper 一步法荧光定量PCR试剂盒/With ROX  Master mix的优化 Hotstar 化学修饰，低温下酶活抑制强，热复活需10分钟 Fast Hotstar 抗体或oligo修饰，热复活仅需几十秒 CW0696 CW0704 热启动DNA聚合酶 反应条件优化 内参基因 单一特异性产物 反应效率90%-110% 反应条件优化 目的基因 单一特异性产物 反应效率接近内参基因 反应效率尽量高 内参基因  高丰度 ACTB，GAPDH 中等丰度 beta2M 低丰度 HPRT1 * 扩增产物设计原则 二级结构 颈环结构 片段长度 75-200bp 最佳长度 80-120bp 有限的二级结构 二级结构的预测用mFold /mfold/applications 引物避免位于颈环结构上 总原则与普通PCR相同 二级结构 Company name 扩增产物的二级结构 引物避免位于颈环结构上 Company name 引物的位置 Company name 55℃ 60℃ 65℃ 温度对二级结构的影响 Company name 实 践 Company name 实 践 内参基因的标准曲线的 绘制与数据分析 Company name 样本：293T细胞株 人 提取方法：Trizon RNA 提取试剂 CWBIO 公司 CW0580说明书 2×106 个细胞总RNA 琼脂糖凝胶电泳图 RNA提取 Company name 逆转录：HiFi-MMLV cDNA 第一链合成试剂盒 CWBIO 公司 CW0744说明书 取5ul扩增产物，用1.7%琼脂糖凝胶进行电泳 体系： 2 × TaqMasterMix 10ul GAPDHF引物（10um）0.5ul GAPDHR引物（10um）0.5ul cDNA 1u 加入灭菌水至20 ul。 逆转录 Company name 模板 cDNA 模板稀释倍数 10000倍 1000倍 100倍 10倍 引物 内参基因引物 模板 反应体系的配置 cDNA 模板 2.0μl 正向引物F(10μM) 0.5μl 反向引物R (10μM ） 0.5μl REALSYBR Mixture(2×) 10.0μl ddH2O 7.0μl Total 20.0μl Company name 注意：1、为了避免加样误差，做预混体系 2、充分混匀，如有气泡短暂离心 Company name 95℃ 5min 95℃ 10-15sec 60℃ 20-30sec Plate read Go to 2 for 39 cycles more Melting curve analysis: from 72℃ to 95℃, read every 0.2 ℃, hold 1sec between reads End Tm值：DNA解链一半时的温度 将荧光强度的变化对温度求导：-dI/dT