实验五.血蛋白醋酸纤维素薄膜电泳分离.pptVIP

血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳  ??电泳技术--电泳的基本概念和原理 一、概念：电泳是指带电质点在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。 二、原理：在一定PH条件下，不同的物质具有不同的等电点就带不同性质的电荷，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，因此，可使它们分离。 质点在电场中的移动方向决定于颗粒所带电荷的种类：带正电荷的颗粒向电场的负极移动；带负电荷的颗粒向正极移动；净电荷为零的颗粒在电场中不移动。 颗粒在电场中移动的速度主要决定于颗粒带电荷的量，同时受颗粒形状和颗粒相对分子质量的大小的影响。 在电场中，颗粒的移动速度，通常用泳动度（或迁移率）来表示。泳动度是带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度即： v d/t d L μ＝---=-------=----·---- E V/L V t 式中：μ－泳动度（即迁移率），cm2 /（V·s）； v－泳动速度，cm/s； E－电场强度，V/cm； d－颗粒泳动距离，cm； V－实际电压，V（伏特）； t－通电时间，s（秒）； L－介质的有效长度（cm）。 通过测量d、L、V、t即可计算出颗粒的泳动度。 在一定条件下，任何带电颗粒都具有自己特定的泳动度，它是胶体颗粒的一个物质常数，可用其鉴定蛋白质等物质。 三、影响电泳泳动度的因素： 1、颗粒性质：颗粒的直径、形状及所带静电荷量对泳动速度有较大影响。一般来说颗粒带净电荷量越多，或其形状越接近球形，在电场中的泳动速度就越快。反之则越慢。 2、电场强度：电场强度是指每一厘米的电位降。又称为电位梯度或电势梯度。它对泳动速度起着十分重要的作用。电场强度越高，带电颗粒的泳动速度越快。反之，则越慢。根据电场强度（电压的高低）大小，又可将电泳分为常压电泳（100－500V）和高压电泳（500－10000V）。前者电场强度为2－10伏特/厘米，后者为70－200伏特/厘米。常压电泳多用于分离大分子物质。高压电泳常需要冷却装置。高压电泳时间短，有时仅需数分钟，多用于分离小分子物质。 3、溶液的性质：主要是指电极溶液（缓冲溶液）和蛋白质样品溶液的pH值、离子强度和粘度等。 （1）pH值：溶液pH值决定带电颗粒的解离程度，也即决定其带净电荷的量。对蛋白质而言，溶液的pH值离其等电点越远，则其带净电荷量就越多，从而泳动速度就越快。反之，则越慢。当pH值等于其PI时，净电荷为0，μ也为0。因此电泳时应选择适宜的PH值，并需采用缓冲溶液，使溶液的pH值恒定。 （2）离子强度：溶液的离子强度一般在0.02－0.2之间时，电泳较合适。若离子强度过高，则会降低颗粒的泳动速度。其原因是，带电颗粒能把溶液中与其电荷相反的离子吸引在自己周围形成离子扩散层。若离子强度过低，则缓冲能力差，往往会因溶液PH值变化而影响泳动的速率。 离子强度的计算公式为： I＝1/2Σmizi2=1/2(m1z12+m2z22+…mnzn2) I－溶液的离子强度； mi－离子的摩尔浓度； zi－离子的价数 1，2，…n－代表各种离子。 （3）溶液粘度： 泳动度与溶液粘度是成反比关系。因此，粘度过大或过小，必然影响泳动度。 4、电渗：当支持物不是绝对惰性物质时，常常会有一些离子基团如羧基、磺酸基、羟基等吸附溶液中的正离子，使靠近支持物的溶液相对带电。在电场作用下，此溶液层会向负极移动。反之，若支持物的离子基团吸附溶液中的负离子，则溶液层会向正极移动。这种溶液层的泳动现象称为电渗。 因此，当颗粒的泳动方向与电渗方向一致时，则加快颗粒的泳动速度；当颗粒的泳动方向与电渗方向相反时，则降低颗粒的泳动速度。 A B ///////////////////// ///////////////////// － － － － ++++++++++ － ++++++++++ － － － －