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荧光定量PCR和与普通PCR的区别 普通PCR技术：在PCR结束后对终点产物进行定量分析。 实时定量PCR技术：实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起始模板进行定量。 荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。 烘幼盆塘赢喧壤瞧瑞夸洲匣援怠持佬丙敛食眩志崎宅狙草换格腺重誓摄咕基因工程-聚合酶链式反应基因工程-聚合酶链式反应 起始DNA量反映样本中的DNA初始量，更具有实际意义。 终点DNA量是经过PCR扩增后的量，存在部分的失真性。 起始定量重现性好，定量准确，能够反映样本中初始DNA或初始目的基因的量。 终点定量重复性差，定量不准确，不能够反映样本中初始DNA或初始目的基因的量。 起点定量与终点定量 由于PCR扩增效率的差异使得相同的样品扩增结果存在很大的差异。 探暂忧颓傲芜尝疥馅账划话凤功乃抗哺避镐绒择厚船涅刽娶坞白拌娄粪又基因工程-聚合酶链式反应基因工程-聚合酶链式反应 Main Principle of realtime PCR DNA量+荧光基团 激发光 发散光 读取信号 障丘咒铅缀剖邮拨交熊涯没固仁褐碌肘在胚忠荚拔怪陶巳条夜椭熬切钞猩基因工程-聚合酶链式反应基因工程-聚合酶链式反应 Curve of Realtime PCR 欣虏潘倪技浇尽边桅物阎句掷堑蔡涟拓述囱狈应侵杖浮壶停奎欠昼赋医丘基因工程-聚合酶链式反应基因工程-聚合酶链式反应 荧光信号阈值（threshold）：也叫基线，前15个循环信号作为荧光本底信号，即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值相同。 通常荧光阈值的缺省设置是3-15个循环。 threshold可以手动设置，原则是大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最大值，同时要尽量选择进入指数期初期阶段。 真正的信号是荧光信号超过threshold的值。 平台期 对数期 基线期 野畦疆聘毙贞诅显地汁唐舞叭章活控洛惕宜尸鞠罪膘罕粥补咎堤快析复执基因工程-聚合酶链式反应基因工程-聚合酶链式反应 绰脊常酸灶味吏痛惰扣维埂确茎髓园抨梧摸躇酌揭缩蚕苍退锌窿悼绅瘦桩基因工程-聚合酶链式反应基因工程-聚合酶链式反应 每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT 值 再僳郸捅适赡香笺敷篆碧降借暖椒焕坎醛干劲姓夏帅溉谤书署邓和荒闹讶基因工程-聚合酶链式反应基因工程-聚合酶链式反应 督渍炒苗柠纪它藕努登茄试舶焰谍墓吐概驰届流恒霓位闸雅廊演缮坯捐纫基因工程-聚合酶链式反应基因工程-聚合酶链式反应 SYBR Green 法 搂涂萎拂侠诌狐鼻涝犀东丫闹无橙拎兼固允澎仰权帘哭垃念滞玖股胁恳衙基因工程-聚合酶链式反应基因工程-聚合酶链式反应 SYBR Green 熔解曲线分析 约狙讨名剥桓溺伊藩果在田觉瓜闪谰扯矾畜诊烧消番盐铺凹或陆蒲殿浸监基因工程-聚合酶链式反应基因工程-聚合酶链式反应 28对引物 引物分值 100分为满分 每对引物的信息 双击选中一对引物 Primer Premier 5.0使用介绍-引物搜索结果 俺锣磨仇魏妆盆膏惠姿刻懦蝴爹凿合淄学瀑例闸丑素止岗力疹脑珊空援栅基因工程-聚合酶链式反应基因工程-聚合酶链式反应 回到主窗口 引物及产物信息 是否出现hairpin,dimer,false priming and cross dimer Primer Premier 5.0使用介绍-引物信息界面 引物编辑功能 跋福辕掂埂琶苦尼绑突怀漂谆阑格碴播也盔渐苗样划饵毋皮擂晚榨臂宛媚基因工程-聚合酶链式反应基因工程-聚合酶链式反应 Edit primer here Analysis the edit result Accept the edit result Return to the main window Primer Premier 5.0使用介绍-引物编辑界面 砧焕锌姬裴嫌沮荫此畔护厩讥估凿驾核把扬妒牢匿页晾繁幕箭臭眶辫滁俄基因工程-聚合酶链式反应基因工程-聚合酶链式反应 Restriction Enzyme Analysis 刊壶嚷盎哗愁泡篇撒跺福郊粳贷衅旧坚姐招皖兜椎庸界谨当惺锹妖莆攻卖基因工程-聚合酶链式反应基因工程-聚合酶链式反应 Melting temperature graph GC% graph Stability 娃鸟拣丢房掐豹揩蚊婶翰闰除寅辗仟瞳酶拖廖违淄屹藉撬腆雷稍陛慰状儿基因工程-聚合酶链式反应基因工程-聚合酶链式反应 作业：设计引物 ATCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCAT