第七章分子生物學研究方法(课件11).doc

课件11 第七章 分子生物学研究方法 Techniques of Molecular Biology 第一节 基因操作 第二节 主要载体系统 第三节 基因的分离与鉴定 第四节 基因表达研究技术 第五节 DNA序列测定 第六节 蛋白质组学研究技术 第一节 常见基因操作 DNA分子的切割与连接 核酸分子杂交凝胶电泳 凝胶电泳细胞转化 核酸序列分析 核心技术 基因的人工合成 基因的定点突变 PCR扩增等 ⒈ DNA克隆概述 （1）克隆概念： 多细胞的高等生物个体水平上：同一受精卵分裂而来的单卵双生子（monozygotic twins）便是属于同一克隆。 在细胞水平上：指由同一个祖细胞（progenitor cell）分裂而来的一群遗传上同一的子细胞群体。 DNA克隆（基因克隆）？ 从单一祖先产生同一的DNA分子群体的过程 （2）重组DNA技术简单概括为： “分”——目的基因的获取 “切”——基因载体的选择与构建 “接”——目的基因与载体的拼接 “转”——重组DNA分子导入受体细胞 “筛”——筛选并无性繁殖含重组分子的受体分子 （转化子） ⒉ 限制酶与电泳 1962年Arber 发现限制性核酸内切酶 1967Gellert发现了 DNA 连接酶 工作原理图 ⑴ 限制性核酸内切酶(restriction enzyme) 识别双链DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。 分类：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型。Ⅱ类酶识别序列特点为回文结构。 ?¤?¤?¤ GGATCC ?¤?¤?¤ ?¤?¤?¤ CCTAGG ?¤?¤?¤ 命名： EcoRⅠ(E：属名；co：种名；R：株；Ⅰ：发现次序) 限制性核酸内切酶作用后产生两种末端： — 粘性末端(cohesive end)和钝性末端(blunt end) 钝性末端(blunt end) 限制性核酸内切酶识别序列长度为4~8个bp。 同工异源酶：来源不同,但能识别和切割同一位点 Hpa II -----CCGG---- Msp I ----GGCC---- ⑵ 核酸的凝胶电泳（Gel electrophoresis） 基本原理： 电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型 琼脂糖凝胶电泳（Agarose electrophoresis） 琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2—50kb之间 聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide electrophoresis） 分辨能力强，但分辨范围窄(1~1000bp)。 脉冲电场凝胶电泳(Pulsed-field gel electrophoresis) 大肠杆菌 冰冷的CaCl2 42oC热击 筛选 （预先处理的0oC） ⒊ 细菌转化(Transformation) a)概念： 指一种细菌菌株由于捕获了另一种细菌菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。 b)方法——CaCl2 法 c) 感受态细胞转化频率的计算方法： 转化总数 = 菌落数×（转化反应原液总体积/涂板 菌液体积） 插入频率 = 白色菌落数/（白色菌落数 + 蓝色菌落数） 转化频率（每μgDNA转化菌落数）= 转化体总数/加入质粒DNA总量（μg） ⒋ DNA体外扩增技术 （polymerase chain reaction, PCR） PCR基本原理 PCR三步曲 5. 基因敲除技术及应用 Forward Genetics (1) 基因敲除的概念 基因敲除（gene knock-out）又称基因打靶，该技术通过外源DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改造，具有专一性、染色体DNA与目的片段共同稳定遗传等特点。 完全基因敲除：通过同源重组法完全消除细胞或动物个体中的靶基因活性。 条件型基因敲除：通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除。 (2) 完全基因敲除策略 在ES细胞中进行基因打靶最常用的策略是置换型载体的正-负双选择（positive-negative selection, PNS）： 正向选择基因neor通常插入载体靶DNA功能最关键的外显子中，或通过同源重组法置换靶基因的功能区。该基因的表达可以抵抗G418对细胞的致死效应。 负向选择基因HSV-tk（human semian virus-thymidine kinase）则被置于目的