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3、PCR诱变 （1）四引物法 (重组PCR：Recombinant PCR) R. Higuchi等人首创，突变反应需要四个引物，共进行三轮反应 ① 头两轮反应应用两个互补的、并在相同部位具有相同碱基突变的内侧引物，扩增形成两条有一端可彼此重叠的双链DNA片段，且重叠区内有同样突变 ② 去除未掺入多余引物，将两对双链DNA片段变性，退火，形成两种不同形式的异源双链分子 ③ 具有3′-凹陷末端的双链分子在Taq DNA Pol.作用下生成目标突变体 PCR反应分开做！ 试管1 试管2 （2）三引物诱变法 (大引物诱变法，Megaprimer method of mutagenesis) 以第一轮PCR产物作为第二轮PCR扩增的大引物，简化反应步骤，获得突变DNA的方法 （3）两引物PCR定向诱变法 Exsite TM PCR-Based Mutagenesis 突变反应仅需两个引物，突变位点设置于一个引物末端，使用高效的 Pfu DNA Pol. 进行高温长片段DNA PCR扩增，可定向地引入碱基替代，缺失和插入定向突变 替代突变 缺失突变 插入突变 主要参考文献 [1] Sang