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酵母双杂交技术论文《The ATG1/ATG13 Protein Kinase Complex Is Both a Regulator and a Target of Autophagic Recycling in Arabidopsis》中使用了多种研究蛋白互作的技术，其中包括酵母双杂交技术。1.技术原理酵母双杂交系统首先在研究真核基因转录调控中建立起来。GAL4包括两个彼此分离但功能必需的结构域：位于N端的DNA结合域 (DNA-binding domain, BD) 和位于C端的转录激活结构域 (Activation domain, AD) 。BD能够识别位于GAL4效应基因上游的激活序列 (Upstream activating sequence, UAS) ，并与之结合。BD单独作用并不能激活效应基因的转录，但当BD和AD在空间上充分接近时，呈现出完整的GAL4转录因子活性，激活UAS下游基因的转录[33]。融合基因的表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录，但由于GAL4-AD没有核定位序列，因此在GAL4-AD氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位序列。在酵母双杂交系统中，bait蛋白与BD连接，形成融合蛋白BD-bait；prey蛋白与AD连接，形成融合蛋白AD-prey。当bait蛋白和prey蛋白互作时，BD和AD的距离被拉得很近，能够激活报告基因的转录。2.实验原理：论文中使用了酵母营养缺陷型菌株MaV203，其不能在缺乏色氨酸、亮氨酸、和组氨酸的培养基上生长。MaV203包含三种受到UAS调控的报告基因：HIS3、LacZ和URA3，当BD-bait蛋白和AD-prey蛋白互作时，激活报告基因的表达，这样菌株能够在缺乏组氨酸的培养基上生长。实验中将ATG1，ATG13，ATG5，ATG7，ATG8基因分别导入pDEST22和pDEST32载体。pDEST22载体上包含GAL4-AD序列和Trip基因，pDEST32载体包含GAL4-BD序列和Leu2基因。当两种重组载体成功导入酵母细胞时，酵母细胞都能在缺乏色氨酸和亮氨酸的酵母培养基上生长。URA3是酵母V号染色体上的一个基因，能编码乳清苷5-磷酸脱羧酶。如果向培养基中加入5-FOA (5-氟乳清酸) ，那么乳清苷5-磷酸脱羧酶能将5-FOA转化为有毒物质，从而抑制细胞生长。TL培养基不含色氨酸和亮氨酸，TLH培养基不含色氨酸、亮氨酸和组氨酸。当两种重组载体没有同时导入酵母细胞中时，酵母细胞不能在TL培养基和TLHA培养基上生长；当两种重组载体成功导入酵母细胞但目标蛋白不能互作时，酵母细胞能在TL培养上生长，不能在TLH培养基上生长；当两种重组载体成功导入酵母细胞且目标蛋白能发生互作时，酵母细胞能同时在两种选择性培养基上生长。同时，如果目标蛋白间发生相互作用，将激活URA3基因的表达，则酵母细胞不能在缺少色氨酸、亮氨酸和组氨酸并含有5-FOA的培养基上生长。3.实验步骤3.1实验前的准备酵母生长TEPD液体/固体培养基的配制 (1L) ：酵母提取物 (Yeast extraction) 10g细菌蛋白胨 (Bacto-peptone) 20g硫酸腺嘌呤 (Adenine hemisulfate salt) 50mg蔗糖 (Glucose) 20gPH 5.8琼脂 (Agar) 15gTL选择性培养基（无色氨酸和亮氨酸）的配制 (1L) ：酵母氮源 (Yeast Nitrogen base) 6.7gDrop out-TL (Clontech，ref.630417) 0.64g硫酸腺嘌呤 (Adenine hemisulfate salt) 50mg蔗糖 (Glucose) 20g琼脂 (Agar) 15gTLH选择性培养基（无色氨酸、亮氨酸、组氨酸）的配制 (1L) ：酵母氮源 (Yeast Nitrogen base) 6.7gDrop out-TLH (C