第二章细胞的破碎与分离试卷资料.ppt

第二章 细胞的破碎与分离Cell Disruption and Separation 生物分离过程的一般流程 主要内容 概述　细胞破碎 细胞壁的结构和化学组成 细胞壁的破碎 　方法　试剂　设备　 1 概述 不同类型的细胞分泌目标产物的类型： 动物细胞多分泌到细胞外培养液 植物细胞多为胞内产物 微生物（细菌/酵母/真菌）胞内、胞外 对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行破碎。　 1概述 大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖，及氨基酸等目标产物存在于发酵液中。 有些目标产物存在于生物体中。 尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质是在细胞内沉积。 脂类物质和一些抗生素包含在生物体中。 1 概述 胞外产品：各种胞外酶、胞外多糖、细胞代谢物如氨基酸、抗生素 细胞本身： 单细胞蛋白 如面包酵母 胞内产品： 各种胞内酶、基因工程产物 1 概述 目标产品位置 1.概述 细胞破碎 指采用一定的方法，在一定程度上破坏细胞壁和细胞膜，设法使胞内产物最大程度的释放到液相中，破碎后的细胞浆液经固液分离除去细胞碎片后，再采用不同的分离手段进一步纯化。 细胞破碎指选用物理、化学、酶或机械的方法来破坏细胞壁或细胞膜。 细胞破碎 本质上是一种增溶作用，细胞破碎的阻力来自于细胞壁的结构和组成的差异。 细胞的结构根据细胞种类而异，动物、植物和微生物细胞的结构差异很大。 动物细胞、嗜盐菌和支原体没有细胞壁，易于破碎； 植物细胞和微生物细胞有坚固的细胞壁，破碎困难，需用强烈的破碎方法。 2细胞壁的结构和化学组成 原核生物细菌 肽聚糖、多糖、磷壁酸，主要阻力来自于肽聚糖的网状结构；革兰菌细胞壁结构图 真核生物酵母菌 葡聚糖、甘露聚糖、蛋白质，主要阻力来自于壁结构交换的紧密程度和厚度；酵母细胞壁结构示意图 真菌 多糖、蛋白质、脂类、葡聚糖、几丁质，主要阻力来自于壁强度和聚合物网状结构。 革兰菌细胞壁结构图 酵母细胞壁结构示意图 各种微生物细胞壁的结构和组成 微生物的细胞壁都由网状的高分子聚合物构成，破碎的难易程度主要取决于构成细胞壁的聚合物的种类及细胞壁的厚度和强度。 植物细胞壁的结构 对于已生长结束的植物细胞壁可分为初生壁和次生壁。 初生壁是细胞生长期形成的。初生壁一般较薄(1～3μm)，富有弹性。由多糖和蛋白质构成，多糖主要成分为纤维素、半纤维素和果胶类物质。纤维素是长链D-葡聚糖，许多这样的长链形成微纤丝，构成细胞壁的骨架，细胞壁的机械强度主要来自于微纤丝。 某些植物细胞，当生长停止后，在细胞质和初生细胞壁之间形成了次生细胞壁。次生壁一般较厚(4μm以上)，纤维素和半纤维素含量比初生壁增加很多，纤维素的微纤丝排列得更紧密和有规则，而且存在木质素的沉积。因此次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性，使植物细胞具有很高的机械强度。 3 细胞壁的破碎 3.1破碎率的评价（三种） 破碎率：被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比数。 Y(%)=(N0-N)/N0×100 N0:原始细胞数量； N：t时间操作后未损害完整细胞数量； 1）直接测定法 利用显微镜或电子微粒计数器可直接计数完整细胞的量。 染色法 例如，破碎的革兰氏阳性菌可染色成革兰氏阴性菌的颜色，利用革兰染色法使未受损害的酵母细胞呈现紫色，而受损害的酵母细胞呈现亮红色。 2)目的产物测定法 蛋白质量或酶的活力 细胞破碎后，测定悬浮液中细胞内含物的增量来估算破碎率。 通常将破碎后的细胞悬浮液离心，测定上清液中蛋白质的含量或酶的活力，并与100%破碎所获得的标准值直接比较。 3)导电率测定法 细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相，使导电率上升。 3.2 细胞破碎的方法 1)机械法 珠磨法 高压匀浆法 超声波法 1)－1固体剪切方法 珠磨法 (bead mill) 原理：进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。破碎中产生的热量一般采用夹套冷却的方式带走。 适于绝大多数微生物细胞的破碎，更适合于真菌菌丝和藻类。 珠磨法 (bead mill) 实验室规模的细胞破碎设备有Mickle高速组织捣碎机、 Braun匀浆器； 中试规模的细胞破碎可采用胶质磨处理； 在工业规模中，可采用高速珠磨机(瑞士WAB公司和德国西门子机械公司制造)。 珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：降低能耗、减少大分子目的产物的失活、减少由于高破碎率产生的细胞小碎片不易分离而给后续操作带来的困难。 珠磨法(bead mill)　特点： 适用对象较广 工业化、实验室中应用 细胞完全破碎 需冷却 1）－2 液体剪切方法 高压匀浆法High-