聚合酶链反及基因突变检测方法.ppt

聚合酶链反应及基因突变检测方法 上海交通大学医学院 刘湘帆 讲师 聚合酶链式反应于1983年由美国Cetus公司的K.Mullis建立，并和定点突变的发明者M.Smith一起荣获1993年度诺贝尔化学奖，为生命科学领域的研究开创了崭新时代。 一、PCR反应原理和反应过程 DNA的体外复制包括3个步骤： 变性（denaturation）:94 ?C ~95 ?C 退火（annealing）:40 ?C ~70 ?C 延伸（extension）:72 ?C 3个步骤作为PCR的一个循环，每当完成一个循环，一个分子的模板被复制为二个，产物量以指数形式增长。 二、PCR的反应体系和反应条件 （一）PCR反应体系 参与PCR反应的主要成份: 模板、引物、dNTP、Taq DNA聚合酶和 缓冲液等。 1 模板 包括基因组DNA、RNA、质粒DNA、线粒体DNA等 模板DNA需较高的浓度 RNA作为模板时，须先将RNA逆转录为cDNA，再以 cDNA作为扩增的模板 模板量：1000ng、500ng、100ng、50ng? 2、引 物（Primers) 引物决定PCR扩增产物的特异性和长度，是化学合成的寡核苷酸片段 化学合成的寡核苷酸 能与模板特异地结合 引物决定产物的特异性和长度 引物设计时必须遵循一些原则 设计引物的原则： 二条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板正负链序列互补 长度为18 ~ 25个核苷酸 二条引物之间避免形成引物二聚体 引物的碱基组成应平衡 引物退火温度计算：Tm=2（A+T）+4（C+G） 引物的5`端可被修饰（引入酶切位点、引入突变位点、生物素等标记） 3、脱氧核苷三磷酸（dNTP） 是dATP、dCTP、dGTP和dTTP4种脱氧 核苷三磷酸的混合物 反应体系中各种核苷酸的浓度必须一致 浓度过高虽能加快反应速度，但非特异 性扩增也随之增加 dNTP浓度：20 ~ 200umol/L,浓度升高增加非特异性扩增 4、DNA聚合酶 从一种生活在热泉（80℃~90℃）中的水栖 噬热菌（Thermus aquaticus, Taq）中提取， 有很高的耐热稳定性 Taq 酶的作用: 模板指导下，以dNTP为原料，在引物3’-OH末端加上脱氧单核苷酸，形成3’, 5’ -磷酸二酯键，使DNA链沿5’→3’方向延伸，催化DNA合成。 最适酶量：1-2.5U （酶量过多，导致非特异性扩增） Taq DNA聚合酶复制的保真性： Taq DNA聚合酶无3’ → 5’外切酶活性，因而无校正功能，在复制新链的过程中会发生碱基错配。 Taq DNA聚合酶在每次循环中产生的移码突变率为1/30000，碱基替换率为1/8000，故扩增的片段越长，错配的机率越高。 耐热的 DNA多聚酶： Pwo DNA polymerase、Tth DNA polymerase、Pfu DNA polymerase具有较高的热稳定性，较高的保真性，降低碱基错配率2 ~ 10倍。 5、镁离子浓度 镁离子浓度是一个至为关键的因素，对于反应 系统本身、稳定核苷酸和提高Taq 酶的活性有直接影响 虽然Taq 酶的活性只与游离的Mg2+浓度有关， 但PCR反应体系中dNTP、引物、模板DNA及 鳌合剂的存在均可与Mg2+结合而降低游离 Mg2+的浓度从而影响酶的活性。 当dNTP浓度为200umol/L时，MgCl2的浓度为1.5mmol/L较宜。 6、其它反应因素 pH：调节至酶反应所需的最适pH（ pH =7.2左右） 盐：合适的盐浓度有利于稳定杂交体，有利于引物与模板杂交 基质：BSA、gelatin 、Tween20、DTT等（牛血清白蛋白或明胶等基质可以保护Taq 酶的活性） （二）PCR的反应条件 反应温度（变性、退火、延伸） 反应时间（变性、退火、延伸） 循环次数（PCR效率及产物量） 1、温度 变性温度：94 ~ 97 ℃ 退火温度：低于引物Tm 5 ℃左右 温度过高：降低扩增效率； 温度过低：增加非特异性扩增 延伸温度：72度，此时Taq酶具有较高的酶 促活性 2、时间 第一次变性应给予足够时间（5 ~ 7分钟） 每一个步骤所需时间取决于扩增片段的长度，一般为30秒~ 1分钟，时间过长易导致非特异性扩增 3、循环次数 重复次数一般设为25～35个循环 扩增反应的平台效应： 理论上，PCR反应产物呈指数性增长，但这种增长形式在扩增