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第四章 基因工程制药 在制药业中，医药产业经历了3 个不同的历史阶段: 天然药物 通过化学方法合成的药物 基因工程药物 基因工程药物3 个阶段: 其一是细菌基因工程，即把目的基因通过适当的改建导入大肠杆菌中，再通过细菌等原核微生物表达的目的蛋白作为药物; 其二是细胞基因工程药物，这是把人或哺乳动物的基因直接导入哺乳动物的细胞中，生产有生物活性的产品; 其三是利用转基因动物生产低成本、高活性的药物。 （1）免疫性蛋白，如各种抗原和单克隆抗体； （2）细胞因子，如各种干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子、表皮生长因子、凝血因子； （3）激素，如胰岛素、生长激素、心素纳； （4）酶类，如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白溶酶原激活剂、超氧化物歧化酶。 二、基因工程技术生产药物的优点 （1）利用基因工程技术可大量生产过去难以获得的生理活性蛋白质和多肽，为临床使用提供有效保障； （2）可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的使用范围； （3）利用基因工程技术可以发现，挖掘更多的内源性生理活性物质； （4）内源生理活性物质在作为药物使用存放的不足之处，可以通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除； （5）利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。 三、我国基因工程药物研究和开发 起步较晚，基础较差。 α1b 型基因工程干扰素是由我国自行研制开发的具有国际先进水平的生物高科技成果，于1997年 通过Ⅲ 期临床，并获得国家一类新药证书，成为“863”计划生物技术领域第一个实现产业化的基因工程药物。 目前我国已批准12种基因工程药物和疫苗上市，在研究开发中的也有10余种。 四、基因工程药物生产的基本过程 定义：基因工程技术是指将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌（或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达。 1、上游阶段：首先获得目的基因，然后用限制性内切酶和连接酶将其插入适当的载体质粒或噬菌体中并转大肠杆菌或其它宿主菌（细胞），以便大量复制目的基因。选择基因表达系统主要考虑的是保证表达功能，其次要考虑的是表达量的多少和分离纯化的难易。其中的（1）、（2）、（3）步骤属于上游阶段，在实验室完成。 2、下游阶段：将实验室成果产业化、商品化，它主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度纯品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等。上述（4）、（5）、（6）、（7）、（8）等属于下游阶段。 第二节 基因工程药物的表达 一、药物基因的分离 二、基因表达 1、mRNA的纯化 2、cDNA第一链的合成 3、cDNA第二链的合成 4、cDNA克隆 5、将重组体导入宿主细胞 6、cDNA文库的鉴定 7、目的cDNA克隆的分离和鉴定 用于cDNA克隆的载体有两类： 质粒DNA和噬菌体。又将其分为表达型载体和非表达型载体。选用表达型载体可以增加目的基因的筛选方法，有利于目的基因的筛选。 cDNA片段与载体的连接通常采用下面方法： 加同聚尾连接：在载体和cDNA的3’末端加上互补的同型多聚酶序列。 人工接头连接：所谓人工接头是指用人工合成的、连接在目的基因两端的含有某些限制酶切点的寡核苷酸片断。 前提：较小的蛋白质或多肽的编码基因，必须知道目的基因的核苷酸排列顺序，或知道目的蛋白质的氨基酸顺序，再按相应的密码子推导出DNA的碱基序列。 限制： （三）RT-PCR 逆转录－聚合酶反应法。该方法是mRNA经逆转录合成cDNA第一链，不需再合成第二链，而是在特异引物的协助下，用PCR法进行扩增，特异地合成目的cDNA链，用于重组，克隆。 （一）宿主细胞的选择 基因工程重组药物宿主的选择主要考虑产物的活性表达和宿主的安全性。 一般的原则是根据所用的载体体系及各种受体细胞的基因型进行选择，要使重组体的转化或转染效率高、能稳定传代、受体细胞基因型与载体所含的选择标记需匹配。 1、原核细胞 2、真核细胞 （二）大肠杆菌中的基因表达 1、载体 表达载体必须具备的条件： （1）载体能够独立的复制 （2）具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记 （3）具有很强的启动子 （4）具有阻遏子 （5）有很强的终止子 （6）有翻译的起始信号 常用的表达载体： （1）pBV220系统 （2）pET系统 3、真核基因在大肠杆菌中的表达形式 （1）以融合蛋白的表达形式表达药物基因 由一段短的原核多肽和真核蛋白结合在一起的蛋白质，称为融合蛋白。 （2）以非融合蛋白的形式表达药物基因 （3）分泌型表达蛋白药物基因 2、影响目的基因在酵母菌中表达的因素 （1）外源基因的拷贝