DGGE——陈芳、陈勍答题.pptVIP

DGGE 变性梯度凝胶电泳 目录 DGGE的原理 DGGE的原理 DGGE的原理 影响因素 DNA分子大小 胶浓度 DNA序列 温度 变性剂梯度 电压/电流大小 电泳时间 DGGE的原理 相关概念 熔解温度（Tm）：即DNA熔解温度，指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度。DNA中G－C含量越高，Tm值越高，成正比关系。 短寡聚核苷酸： Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T) 长寡聚核苷酸： Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size 变性域：一定温度与变性剂浓度下，DNA双链发生解链熔解的区域。 GC夹子：富含GC的一段DNA序列。 DGGE的原理 DGGE将凝胶设置在双重变性条件下：温度50~60 ℃，变性剂0~100%。 根据变性剂方向与电泳方向的关系，可将DGGE分为水平DGGE与垂直DGGE： DGGE的原理 DGGE的原理 Q：DGGE可以用来检测除最高温度解链区域以外的所有发生单个碱基变化的DNA片段，但是最后一个区域的解链，双链变单链，会出现什么结果？如何解决？ A：设计一段富含GC夹子的引物，使DNA 片段的一端加入一段富含 GC 的 DNA 片段（GC 夹子，一般 30-50 个碱基对）以解决双链DNA完全解链的问题。含有GC 夹子的 DNA 片段最高的解链区域在 GC 夹子这一段序列处，它的解链温度很高，可以防止 DNA 片段在DGGE胶中完全解链。当加了 GC 夹子后，DNA 片段中基本上每个碱基处的序列差异都能被区分开。经验表明任何随机的GC序列都能达实验目的。 DGGE装置 DGGE的组成 DGGE的组成 DGGE的组成 DGGE的组成 DGGE的组成 DGGE的操作步骤 制胶 按比例添加含有变性剂的胶液； 添加促凝剂（10%过硫酸铵、四甲基乙二胺）； 按一定的位置将变性剂液加到梯度合成器上； 连接梯度合成器的出口针头； 推动梯度合成器注胶； 冲洗梯度合成器； 插入梳子。 DGGE使用注意事项 1、配置试剂时要使用去离子水，制胶时用的各个容器也要用去离子水洗涤干净，以防止氯离子污染。 2、制胶是实验的关键，注射器要分清高低浓度，高低浓度注射器专用；在往玻璃板中灌胶时，要匀速地转动滑轮，将凝胶液匀速地灌入玻璃板。 3、分别将高浓度、低浓度注射器放在梯度传送系统的正确一侧固定好，注意这里一定要把位置放置正确! 再将注射器的聚丙烯管同 Y 形管相连 4、灌完胶后，立刻清洗注射器，以防丙烯酰胺凝固，堵塞管子。 5、DGGE 的电泳缓冲液高度要超过“RUN”刻度线，不要超过“Maximam”刻度线。 6、点样时，要用小型注射器，伸入点样孔底部点样。 7、剥胶和照相要格外小心，凝胶很薄，容易破裂。 8、每次用完仪器后要及时清理，清洗玻璃板培养皿等玻璃仪器。 DGGE的变形 恒定变性凝胶电泳(CDGE)：均一的变性浓度凝胶 瞬时温度梯度电泳(TTGE)：变性环境是由恒定浓度的尿素和瞬时温度梯度共同形成 温度梯度凝胶电泳(TGGE) DGGE的应用 DGGE的应用 DGGE的应用 2在突变谱和拷贝数确定中的应用 DGGE的应用 3检测DNA聚合酶的忠实性 DGGE的应用 4在人类遗传病和肿瘤基因研究中的应用 DGGE的应用 5在蛋白构象研究中的应用 DGGE的应用 评价发酵食品的细菌群落组成和动态变化 DGGE的应用 DGGE在食品微生物方面的应用 DGGE的评价 优点： 在突变检测中 几乎可以检出所有突变 可将突变分子完好无损地同野生型分子分开用于进一步的分析 无须标记 可检测出象甲基化这样的 DNA 修饰 在微生态研究中 不基于培养（不可培养微生物的检测） 可靠性强 重现性高 方便快捷 DGGE的评价 缺点： 在突变检测中 需要专门设备需要用计算机对序列进行分析 无法确定突变在 DNA 片段中位置 DNA 片段大小限制在 100-500bp 在微生态研究中 检测菌群多样性结果随引物不同具有差异性 无法提供精确的菌群结构信息 无法对菌群数量及代谢活力进行定量分析 DGGE的评价 单双链复合体的构建及应用 单双链复合体的构建及应用 单双链复合体的构建及应用 单双链复合体的构建及应用 单双链复合体的构建及应用 单双链复合体的构建及应用 Quentions Q1：DGGE可以用来检测除了最高温度解链区外所有发生单个碱基变化的DNA片断，但是最后一个区域的解链，双链变为单链，会出现什么结果，如何解决。 A：设计一段富含GC夹子的引物，使DNA 片段的一端加入一段富含 GC 的 DNA 片段（GC 夹子，一般 30-50 个碱基对）以解决双链DNA完全解链的问题。含有GC 夹子的 DNA 片段最高的解链区域在 GC 夹子这一段序列