HCV核酸定量检测.pptxVIP

核酸 定量检测技术丙型肝炎病毒PCRfluorescence quantitative Got youthinking? Hepatitis C Virus的基因结构3’UTR有多聚U区域(poly U)及1段高度保守的98个碱基的区域，称为X-tail。不同基因型的HCV的多聚U有不同的长度。3’UTR末端150个核苷酸序列(包括多聚U区和3’X-tail)含有HCV复制所必需的33’顺式复制元件，可能作为启动子来起始负链RNA的合成。Wehnkti5′UTR 进行序列信息比对GenBank查找全序列DNASTAR软件包中的MegAlign软件，采用Clustal W法确定引物设计序列The performance of the blast中国大陆HCV感染的趋势：中国大陆HCV流行基因型主要为1，2，3和6型，没有发现4和5基因型。中国大陆地区最常见的基因型为1b和2a，流行率为73.1%和18.5%，其次为3a，6a，3b，6n和1a。基因3型和6型的地理分布越来越广。常用的技术荧光染料法荧光探针法Real-time quantitative PCR定量检测常用方法 改进建议TaqMan?/ TaqMan-MGB?Molecular BeaconSYBR Green I 绝对定量 标准曲线由已知浓度的RNA、质粒或合成的寡链核酸生成定量未知模板标准样品和未知样品同时反应先用特异性引物（反向）进行反转录扩增，再以合成的cDNA为模板，以特异性引物（正、反向）进行 PCR 反应Rotor-Gene Q InstrumentsOthers…MGB探针、分子信标此外，现在的试剂盒都是单样本检测，实际运用起来效率比较低同时灵敏度也不够高。高通量高灵敏检测试剂盒开发陈述(presentation)设计再思考HCV病毒体呈球形，属于黄病毒科，为单股正链RNA病毒，在核衣壳外包绕含脂质的囊膜，囊膜上有剌突。HCV基因全长9.6kb，包括一个大的ORF和两侧5′3′非编码区（UTR），分别有319-341bp，和27-55bp，含有几个顺向和反向重复序列，可能与基因复制有关。在5′非编码区下游紧接一开放的阅读框（ORF），其中基因组排列顺序为5-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4-NS5-3，能编码3008一3037个氨基酸的多聚蛋白前体，可经宿主细胞和病毒自身蛋白酶作用后，裂解成各自独立病毒蛋白，即三种结构蛋白，为分子量19KD的核衣壳蛋白（或称核心蛋白，C）和33KD（E1），72Kd（E2/NS1）的糖蛋白，及四种分子量为23KD、52KD、60KD、116KD的非结构蛋白分别与NS2、NS3、NS4、NS5相对应。HCV基因组以5′UTR最保守,各株间同源性≥95%,该区还有两个不变区,常作为PCR引物的核苷酸序列。C、NS3和NS5区相对保守。染料法有两个缺点: 一是它的特异性完全依赖于引物, 所以它并不比常规的RT- PCR 有更高地特异性; 二是荧光信号的强弱依赖于双链DNA 的质量而不是分子数。在扩增效率相同的情况下, 长的扩增产物的信号要强于短的扩增产物。如果扩增效率不同, 那么定量会更不准确。荧光探针杂交，进一步提高了特异性：PCR 扩增中常会出现非特异性扩增和引物二聚体，从而影响了对特异电泳带的判断。FQ-PCR通过特异性探针杂交信号检测PCR扩增产物，相当于PCR反应过程中自动完成了Southern杂交，进一步提高目的基因检测的特异性。常用的制备标准曲线的方法是在质粒载体上用T7或SP6 RNA聚合酶的启动子来亚克隆复制子, 然后用DNAse消化样品, 同时对RNA进行准确定量。重要的是要保证RNA模板是单链的, 并且没有DNA污染。测定RNA的浓度并转化成每微克RNA含多少拷贝数。然后将RNA样品进行梯度稀释, 并分别进行实时定量PCR 测定其Ct值，以Ct值为纵坐标, RNA模板数的对数为横坐标绘制标准曲线。这样待测样品进行PCR后，根据其Ct值结合标准曲线可知准确浓度。dNMP平均相对分子质量330 Dalton.NMP平均相对分子质量345 Dalton.TaqMan 荧光探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5`末端，一般用FAM、VIC、HEX、Cy3、Cy5等荧光基团，而淬灭剂则在3`末端，一般为TAMRA、BHQ1、BHQ2等，其中TAMRA发出黄色荧光，BHQ1和BHQ2不发出荧光。TaqMan 荧光探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5`末端，一般用FAM、VIC、HEX、Cy3、Cy5等荧光基团，而淬灭剂则在3`末端，一般为TAMRA、BHQ1、BHQ2等，其中TAMRA发出黄色荧光，BHQ1和BHQ2不发出荧光。RT和PCR在同一管中进行，反应过程中无需打开管盖，快