发酵工艺实验讲议.docVIP

高产抗菌活性物质菌株诱变育种 发酵工业生产上所用的菌种应具有等特性。但微生物在自然界长期生长与适应，具有稳定、遗传的生长代谢特性，自然界新分离的具有开发利用的野生型菌株，因受其严格的代谢调控，生长过程中代谢产物的合成一般仅满足自身生长繁殖的需要所有代谢产物都不会过度产生从自然界分离获得的产某种目的产物的野生型菌株的生产能力，远不能满足工业生产对菌株生产能力的要求另一方面，微生物普遍具有易变异的特点，自然条件下微生物的变异频率10-6~10-9，而微生物在物理与化学因素的作用，微生物的突变机率可以大地提高，突变后形成稳定的遗传性状。物理、化学方法提高微生物目的产物生产能力的重要方法之一。 加深对微生物菌种选育在发酵工业重要地位的认识； 巩固工业微生物提高目的代谢产物生产能力的途径； 学习掌握微生物紫外诱变育种的基本流程与操作方法 诱变育种是利用诱变剂处理微生物细胞，提高基因突变频率，再通过适当的筛选方法获得高产优质菌种的育种。各种射线γ射线等）、微波或激光紫外线是一种非电离辐射，波长短于紫色可见光而又紧接紫色光的射线波长范围为136～300nm，紫外线波长范围虽宽但有效范围仅限于一个小区域，多种微生物260nm左右的波长最敏感。当物质吸收一定能量的紫外线后，它的某些电子将被提升到较高的能量水平，从而引起分子激发而造成突变；而不吸收紫外线的物质，能量不发生转移，分子也不会激发，不会产生任何化学变化能大量吸收紫外线，极容易受紫外线的影响而变化。紫外线的诱变作用是由于它引起DNA分子结构变化DNA链的断裂DNA分子内和分子间的交连核酸与蛋白质的交联嘧啶水合物和嘧啶二聚体的产生等，特别是嘧啶二聚体的产生对于DNA的变化起主要作用。 不同微生物对紫外线的敏感程度不一，因此不同微生物对于诱变的剂量也不同。在紫外灯的功率、照射距离定的情况下，照射时间决定照射剂量，设计照射不同时间梯度的实验，根据照射不同时间的死亡率，作出照射时间与死亡率的曲线，就可以选择适当的照射剂量。一般以照射后微生物的致死率在90%~99.9% 的剂量为最佳照射剂量，也有倾向于采用率70%~75%甚至更低(30%~70%)的剂量。一般认为，偏低的剂量处理后正突变率较高，而较高的剂量时则负突变率较高，但高剂量造成损伤大、回复少。目前趋向采用低剂量、长时间处理，尽管致死率较高，诱变效果较好。 微生物代谢产物相关的突变多数是产量降低的负突变，生产能力提高正突变是少数。 【材料与试剂】 1 菌种与试剂 菌种：拮抗放线菌斜面菌种，青霉菌（Pennicillium sp.）。 可溶性淀粉KNO3、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4.7H2O、FeSO4. H2O、NaCl、NaOH、HCl、琼脂、大豆粕、玉米淀粉、酵母膏、琼脂、灯用酒精。 2仪器设备 无菌室、全温振荡器、灭菌器、恒温培养箱、离心机、恒温水浴锅、电炉、三角瓶(250mL、500mL) 、酸度计、磁力搅拌器、18×18试管、培养皿(90mm)、紫外灯、脱脂棉漏斗、玻璃珠、1mL移液枪10把、100或1000μL移液枪、血球计数板、玻棒、酒精灯、酒精喷灯等。 培养基 1） 高氏一号培养基（g/L） 可溶性淀粉 20KNO31K2HPO4 1 MgSO4. 7H2O 0.5FeSO4. H2O 0.01NaCl 1 琼脂 15蒸馏水补足1000mlpH 7.2-7.4 2） PDA培养基（g/L）：去皮马铃薯 200（汁）葡萄糖 20琼脂 15蒸馏水补足1000mlpH 6.7 3） 复选液体培养基（g/L） 玉米淀粉 30大豆饼粉 40酵母膏2 蒸馏水补足1000mlpH 8.0大豆饼粉4） 突变菌株筛选混菌平板 将青霉菌斜面孢子无菌水洗下制为孢子悬浮液，调孢子浓度为108个/mL，取1mL孢子悬浮液加入无菌培养皿，倒入PDA培养基，转动培养皿使培养基与孢子混匀、冷凝。 1 菌种活化培养 菌种在高氏一号培养基斜面划线接种，28℃培养6d。 2．单孢悬液制备 用含0.85%NaCl的无菌生理盐水洗下斜面孢子，收集于装有经20粒无菌玻璃珠250三角瓶内，涡旋器上打散未分离的孢子，然后用垫有脱脂棉的灭菌漏斗过滤，制成孢子悬浮液。测定悬浮液的孢子浓度，用无菌生理盐水调孢子浓度为108个/mL。 3．诱变处理 1）紫外线诱变 打开紫外灯(30W)预热20min。取5mL菌悬液放在无菌的培养皿(9cm)中，同时制作5份。逐一操作，将培养皿平放在离紫外灯30cm(垂直距离)处的磁力搅拌器上，照射l min后打开培养皿盖，开始照射，照射处理开始的同时打开磁力搅拌器进行搅拌，时间，照射时间分别为 min、min、min、 min及10min。处理后，诱变菌液在红灯下无菌生理