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茜素红S-Cu(Ⅱ)金属配合物与 牛血清蛋白作用研究 王兴明1，董发勤1，丁立生2（1.西南科技大学 化学与生物工程系 四川 绵阳 621010 2.中国科学院成都生物研究所 四川 成都 610041） 摘要：采用UV-Vis光谱法研究了pH=4.25的缓冲溶液中茜素红S(ARS)-Cu(Ⅱ)配合物与牛血清蛋白(BSA)的结合反应发现ARS-Cu(Ⅱ)-BSA的最大吸收波长为530 nm，比ARS红移100 nm，比ARS-BSA复合物红移 25 nm，比ARS-Cu(Ⅱ)配合物红移15nm。运用摩尔比法回归直线法在530nm处测得ARS-Cu(Ⅱ)-BSA三元配合物的配合比为ARS∶Cu(Ⅱ)︰BSA=8︰4︰1摩尔吸光系数ε=2.34×104 Lmol·cm；ARS-Cu(Ⅱ)配合物与BSA作用的条件结合常数K=5.57×104。ARS-Cu(Ⅱ)与BSA之间的作用力为电荷力和疏水力。关键词：茜素红S-Cu(Ⅱ)-牛血清蛋白配合物；茜素红-Cu(Ⅱ)配合物；牛血清蛋白；UV-Vis光谱法 中图分类号：O621文献识码：A 文章编号：1000-274X(2004)00-07 蛋白质的定量在生物化学、临床医学和食品检验等领域具有重要意义，所使用的方法多种多样，利用有机小分子作为光谱探针测定蛋白质以其简捷、灵敏等优点而被广泛应用。 不同的蛋白质由于结构不同而具有不同的生物学功能，而茜素红S是由天然产物中提取的有机物质。本研究发现，牛血清蛋白(BSA)在一定的酸性条件下可以和茜素红S(ARS)-Cu(Ⅱ)配合物结合，生成三元配合物，致使吸收光谱发生变化。由此，可对BSA与ARS-Cu(Ⅱ)配合物的反应机理进行较深入的研究。这对进一步探索和认识生物大分子BSA的性质、结构、行为、形态、作用机理等具有参考价值，也为进一步揭示生命科学中的奥秘提供一定的科学研究基础及数据。在以前的研究中，偏重于蛋白质与某些有机小分子的结合反应[1~4]，很少涉及三元反应体系[5]，特别是金属配合物作为小分子探针测定研究蛋白质方面更是少有问津。因此，研究蛋白质与有机小分子-金属离子配合物的结合反应，对于探讨包含生物大分子的三元配合物的形成机理和蛋白质的检测等均具有重要意义。 1 实验部分 1.1 仪器与试剂 UV-210型紫外可见光谱仪（日本岛津），PHS-2C型酸度计（成都方舟科技开发公司）。牛血清蛋白（BSA，上海伯奥生物科技有限公司，分析纯），茜素红S（ARS，天津丽晶化工厂，分析纯），Britton-Robinson(B-R)系列缓冲溶液(配制方法：准确吸取2.71 mL 85％的正磷酸，2.36 mL冰乙酸，并称取24 700 g硼酸，用水定容至1 000 mL，用0.20 mol/L NaOH溶液调节pH值)，其他试剂均为分析纯，实验用水均为二次蒸馏水。 1.2 实验方法 在一系列10 mL比色管中，分别加入一定量的ARS、Cu(Ⅱ)、BSA溶液(3种溶液均分别用系列B-R缓冲溶液配制)，分别以相应B-R缓冲溶液定容，摇匀，放置5 min，以水为参比，测定吸收光谱。 在一系列10 mL比色管中，分别加入一定的量ARS、Cu(Ⅱ)、BSA溶液(3种溶液均用pH 4.25的B-R缓冲溶液配制)，以pH 4.25的B-R缓冲溶液定容，摇匀，放置5 min，应用摩尔比法、回归直线法等，以 水或试剂空白为参比，测定吸光度。 2 结果讨论 2.1 吸收光谱 图1是ARS-Cu(Ⅱ)-BSA在不同pH时的吸收光谱，随着pH值的升高，ARS-Cu(Ⅱ)-BSA的最大吸收峰发生红移并逐渐增大；与ARS、ARS-BSA及ARS-Cu(Ⅱ)的吸收光谱(图略)相比，在pH=3.0～6.5处出现了新吸收峰。这说明随着溶液酸度的逐渐减小，BSA逐渐与ARS-Cu(Ⅱ)相互作用形成了新的化合物，溶液颜色由黄色向红色逐渐变化。在pH= 4.0~4.5时，ARS-Cu(Ⅱ)-BSA的最大吸收波长为530 nm，与ARS、ARS-BSA 及ARS-Cu(Ⅱ)相比均发生了不同程度的红移。这说明BSA与ARS-Cu(Ⅱ) 配合物发生了强相互作用，形成的化合物为三元配合物。因此，后续实验选择pH=4.25的B-R缓冲溶液作为研究介质。 图1 不同pH条件下ARS-Cu(Ⅱ)-BSA的吸收光谱 Fig.1 Absorption spectra of ARS-Cu(Ⅱ)-BSA 图2为pH= 4.25时ARS、ARS-BSA、ARS-Cu(Ⅱ)和ARS-Cu(Ⅱ)-BSA的吸收光谱图。从图2可看出，ARS的最大吸收峰在430 nm处，ARS-BSA的最大吸收峰在505 nm处，ARS-Cu(Ⅱ)的最大吸收峰出现在515 nm处，而ARS-Cu(Ⅱ)-BSA