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制药工艺学实验 学习指导书 （第六版） 西南科技大学 生命科学与工程学院 二○一二年二月  实验一 离子交换层析分离混合氨基酸 一.目的要求 学习采用离子交换树脂分离混合氨基酸的基本原理并掌握离子交换层析法的基本操作技术。 二.实验原理 离子交换层析法主要是根据物质解离性质的差异进行分离的方法。本实验用苯乙烯性季铵型阴离子交换树脂分离酸性氨基酸（天冬氨酸pI=2.77）以及碱性氨基酸（赖氨酸 pI=9.74）的混合液。在特定的 pH 条件下，它们与树脂的结合能力和解离程度不同，通过改变洗脱液的pH值或盐离子浓度可进行分离。 三.实验器材和试剂 1.苯乙烯性季铵型阴离子交换树脂（201×7，717型，100-200目） 2.1mol/L HCl、1mol/L Na0H 标准氨基酸溶液：天冬氨酸、赖氨酸各称量100mg，混合加入ddH2O 20ml，置棕色滴瓶避光保存。 洗脱液（pH 4.2的柠檬酸缓冲液）：0.lmol／L柠檬酸54m1加0.1mol／L柠檬酸钠46ml 5.氨基酸显色液（茚三酮溶液）：2g茚三酮溶于100mL无水乙醇中。 6.砂芯层析柱（Ф1×20cm）、试管（Ф1×12cm）及试管架（40孔）、铁架台（带夹）、胶头长滴管、牛角药匙、橡皮筋（捆试管）、250ml抽滤瓶（带砂芯漏斗）、称量纸、pH试纸（1-14）（0.5-5） 7.电子天平（千分之一）、恒温水浴锅、真空泵 四.实验方法 1.树脂的处理：100ml烧杯中置约10g树脂，加25ml 1mol/L HCl搅拌2h，倾弃酸液，用ddH2O充分洗涤树脂至中性。加25ml 1mol/L NaOH 至上述树脂中搅拌2h，倾弃碱液，用ddH2O充分洗涤至中性。再用1mol/L盐酸浸泡2h，转型为Cl-型，最后再用ddH2O充分洗涤至中性备用。（教师准备） 2.装柱：取洁净干燥Ф1×20cm砂芯层析柱1支，用夹垂直固定于铁架台上，关闭下端出口，自顶部沿管壁缓慢加入ddH2O，待液面高于砂芯2cm处停止。然后自顶部缓慢沿壁用玻棒引流注入经处理的树脂的悬浮液（干树脂加少量ddH2O搅拌使树脂悬浮），待树脂沉降后，打开下端出口旋钮逐步放出过量的ddH2O（注意控制流速，保证液面高度不低于树脂层），再补加入一些树脂，直至树脂沉积至12cm高度即可。保持柱床表面水平（不水平，可以用玻棒适当搅拌调整）。当液面高出树脂表面1cm左右时，关闭柱子出口。 3.加样、平衡：打开层析柱下端出口使ddH2O缓慢流出，待液面下弯月面几乎平齐树脂表面时关闭出口（不可使树脂表面干燥，否则加液时会混入气泡）。用胶头长滴管将5滴氨基酸混合液轻轻地滴加到树脂顶部，打开出口使其缓慢流入柱内（1滴/3s）。当液面下弯月面刚平树脂表面时，关闭出口。这时以同样方式在柱顶缓慢注入ddH2O 少许，并打开下端出口，开始平衡，出口溶液立即开始用试管收集，保持流速20滴／min（尽量准确），每管20滴，逐管收存，在收集同时注意用胶头长滴管补充柱床顶部ddH2O（加入时轻缓，勿扰乱柱床顶部也勿使树脂表面干燥）。 在收集洗脱液的过程中，每5管需检验氨基酸的洗脱情况，方法如下：于各管洗脱液中加20滴（约1ml）氨基酸显色液，沸水浴中加热10min，如溶液显紫蓝色，表示已有氨基酸穿透下来。显色的深度可代表浓度，可进行比色测定。 4.洗脱：在检测到第一个氨基酸穿透流出后，再收集两管茚三酮反应阴性部分，关闭层析柱出口，将树脂顶部的剩余ddH2O移去。这时在树脂顶部加入少许洗脱液，打开出口使其缓慢流入柱内，按上述操作方式用洗脱液洗脱并立即开始逐管收集（1滴／3s），每管20滴。同样每收集5管做次氨基酸检测，在第二个氨基酸完全洗脱下来以后，再继续收集两管茚三酮反应阴性部分。最后以洗脱液各管的颜色深浅（以加样洗脱液为空白，其余根据颜色状况以－、±、+、++……表示）为纵坐标，洗脱液管号为横坐标作图，画出洗脱曲线。 5.树脂再生：实验结束后从柱中将树脂取出（用少量ddH2O和玻棒搅拌倒出），用2mol/L HCl浸泡2h，再用ddH2O洗至中性备用。若需长时间保存，请砂芯过滤后置于20%乙醇中避光保存。 四.注意事项 1.装柱时须防止气泡混入树脂层、分层及液面在树脂表面以下等现象发生。 2.使用砂芯层析柱时，轻拿轻放，并注意保护好其它玻璃器皿。 3.水浴时因茚三酮乙醇溶液挥发易引起手部皮肤染色，请尽量用试管夹或毛巾取放试管。 实验结果及思考题 绘制洗脱曲线并完成以下思考题 1.离子交换树脂应如何保存？ 3.如果混合氨基酸中包含中性氨基酸丙氨酸，实验应如何设计？ 附录1：717型树脂特点 别名：强碱性I型阴离子交换树脂 CAS号：122560-63-8