第九章 疾病与人类健康HIV,HBV_幻灯.pptVIP

* * From BMS SS1 * 基本途径是： 个体供者?组织或细胞移植物? 组织培养 治疗基因或标记基因?培养细胞 选择或富集转基因细胞 转染细胞?实验动物或受试病人的靶器官? 1. 离体法（ex vivo）基因转移的治疗途径 基本途径是： 含治疗基因表达载体直接注射/与介质结合后直接注射或用基因枪导入体内 包装细胞系中包装好的复制缺陷型病毒颗粒 优点：简便省时省力，能很快观察到外源基因的表达及作用 缺点：DNA在体内不易进入细胞，易被降解，以病毒颗粒的形式导入人体则易引起免疫反应和被补体灭活。 2. 直接体内法（in vivo）基因转移的途径 基因转移的方法 生物学方法 逆转录病毒载体 腺病毒载体 腺病毒相关病毒载体 单纯疱疹病毒载体 2.非生物学方法 直接注射 脂质体 受体介导 8.4.2 基因治疗的病毒载体 应该具有的基本条件： 携带外源基因并能组装成病毒颗粒 介导外源基因的转移和表达 对机体没有致病能力 充分了解载体病毒的基因组结构和功能（编码区/非编码区、结构蛋白/非结构蛋白、必需基因/非必需基因、包装容量等） 外源基因插入病毒基因组的非必需区 致病基因（裂解细胞、癌基因使细胞转化）?删除 插入外源基因长度受限?删除非必需基因/必需基因（由辅助病毒或宿主细胞提供该基因的功能） 病毒载体的产生 重组型病毒载体 选择性删除部分必需基因，如删除早期调控基因，并导入细胞外源基因弥补该基因功能。 无病毒基因的病毒载体（由重组载体和辅助系统组成） 重组载体：外源基因表达盒、病毒复制和包装所需顺式作用元件 辅助系统：病毒复制和包装所需反式作用元件 优点：安全、容量大 缺点：辅助病毒可能污染产品 病毒载体的产生 病毒载体在基因治疗中的应用 反转录病毒(Retrovirus, RV)载体 优点：基因转移的效率高，细胞宿主范围较广泛，DNA整合效率高于其它病毒载体等。 缺点：只感染分裂状态的细胞，载体容量小（≤8kb），目的基因在未分化的细胞中常丢失，随机整合潜在致癌的危险。 重组反转录病毒载体在转染反转录病毒包装细胞后可获得重组病毒颗粒 优点： 安全，不整合到染色体上 不需要宿主细胞的分裂增殖就能进入细胞 缺点： 免疫原性较强 不能整合到宿主细胞基因组使得外源基因表达持续时间有限 插入外源DNA的能力也有限（≤7kb）。? 腺病毒(AV)载体 缺乏AV时AAV潜伏的感染，当用AAV和AV共感染时，导致裂解感染，产生AAV粒子。 优点： AAV潜伏感染可转导DNA到各种细胞型（无论分裂的和未分裂的细胞） 基因组高度特异性地整合到人基因组中（人19号染色体上单一的整合位点） 缺点：插入外源DNA的能力有限（≤ 4.7 kb） 腺病毒相关病毒（ AAV）载体 腺病毒相关病毒载体系统 优点： 嗜神经组织 能插入较长外源基因（20kb或略长些 缺点： 较大的基因组使得遗传操作较难进行 不整合到宿主细胞基因组，表达持续的时间受限 包含大量功能基因，安全水平尚待进一步观察 疱疹病毒（HSV）载体 ?优点： 安全，痘病毒在人类历史上已经广泛应用 外源基因的容量可达30 kb 适用广泛的细胞型（可感染非分裂的细胞） 缺点： 不整合入细胞基因组，故外源基因表达的时间不能持久 载体过大，受免疫系统的影响也较大。 痘病毒（Poxvirus, PV）载体 基因治疗中问题 基因治疗：治疗基因 导入机体纠正或补偿相应基因功能 1.靶向性基因导入系统 基因治疗的关键问题是将治疗基因送入特定得靶细胞，并在该细胞中得到高效表达； 2.外源基因表达的可控性 导入基因后无调控表达将会产生严重后果。最理想的可控性是模拟人体内基因本身的调控形式； 3.治疗基因过少 导入基因的表达诱导框架图 8.4.3非病毒载体 1. 裸DNA 2. 脂质体/DNA复合物 3. 多聚物/DNA复合物 4. 其它方法 1. 裸DNA 方法：直接注射或基因枪轰击 溶液类型对基因表达有影响： 重组DNA可贮存于5%~30%的蔗糖溶液中 也可用生理盐水或PBS Ballistic DNA Injection, particle bombardment, microprojectile gene transfer (gene guns) Invented for DNA transfer to plant cells Fully applicable to mamalian cells Light micrograph of DNA-coated gold beads in the skin after gene-gun vaccination plasmid DNA is precipitated