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分子生物学实验技术 （研究生、生物技术专业本科生必修课程） 课程简介:分子生物学实验技术已成为高水平医学科学研究中最常用的方法,本课程简要介绍有关基础知识，着重系统地进行有关操作技能的训练。 教学方式：通过实际操作，掌握有关知识和技能。 选课建议：本课程分四部分：DNA分析技术、RNA分析技术、PCR技术、蛋白质分析技术。请根据自己的研究方向所需技术手段选择其中三项内容。每部分人数限定72人（PCR技术不限人数）。 考核办法：实验报告+考试成绩 开设部门：生物科学系 总学时： 80 教学内容： 序号 主要内容 主讲人 实验员 一、DNA制备及分析技术 实验一、质粒的提取和纯化 徐建余 朱壮春 实验二、质粒的酶切、鉴定及片段的回收 周天戟 王艳茹等 二、RNA制备及分析技术 实验三、RNA的提取 实验四、RNA变性琼脂糖凝胶电泳 实验五、探针的标记 实验六、Northern杂交 三、PCR技术 实验七、聚合酶链反应 四、蛋白质分析技术 实验八、SDS及分子量的测定 实验九、Western-Blot 实验十、凝胶图谱分析 “分子生物学实验技术”选课登记表 姓 名 专 业 研究方向 主要研究内容 选择实验课的内容 “分子生物学实验技术”选课登记表 姓 名 专 业 研究方向 主要研究内容 选择实验课的内容 实验一 质粒DNA的提取和纯化 质粒DNA的提取 质粒：pBS[GAPDH]为4.0kb，其pBS载体2.8kb，GAPDH cDNA片段1.2kb。 宿主菌：E. coli HB101 试剂： STE: 0.1mol/L NaCl 10mmol/L Tris·Cl (pH8.0) 1mmol/L EDTA Sol I: (该液可配制100ml，67600 Pa即10磅灭菌15分钟，4(C储存) 50mmol/L Glucose 25mmol/L Tris·Cl (pH8.0) 10mmol/L EDTA Sol II: (含0.2N NaOH、 1% SDS，新鲜配制) 10％SDS 4ml 1N NaOH 8ml 水 28ml Sol III: (含3mol/L KAc、2mol/L CH3COOH, pH4.8) 5mol/L KAc 60ml 冰醋酸 11.5ml 水 28.5ml 碱裂解法小提质粒 提取琼脂板上的单菌落，移至含有3ml LB培养液（含适当的抗生素）的培养三角瓶（20ml），37(C，强烈摇振过夜。（挑出3~5个菌落分别培养） 取出培养液1ml移至Ep管中，4(C，12000g，30秒。 弃上清，用1ml STE悬浮菌体沉淀，再离心回收菌体；再重复用1ml STE悬浮菌体沉淀，离心后，弃上清。 将细菌沉淀悬浮于100(l冷Sol I中，强烈混匀。 加200(l Sol II，颠倒离心管5次混匀悬液，冰浴3分钟（根据不同菌株可适当缩短时间：暴露在强碱性溶液中过长，共价闭合环状质粒DNA可发生不可逆的变性，导致内切酶切割困难，质粒DNA迁移率降低一倍左右，EB染色效率底）。 加150(l Sol III，颠倒混匀10秒，冰浴3-5分钟。 12000g，4(C离心5分钟，取上清移至新Ep管。 加等体积酚/氯仿(1:1)，振荡混匀；12000g，4(C离心2分钟。 取上清至新管，加2倍体积95%乙醇（RT），振荡混匀，室