植酸酶活性的测定方法.docxVIP

计算机在生命科学中的运用植酸酶的活性测定方案 生132-2 201370502239 熊雨洁基本原理随着植酸酶的大规模应用，饲料企业如何选择和鉴别植酸酶产品，已成为使用者的当务之急。 在众多影响使用效果的因素中，产品本身的因素主要包括酶的种源、含量、温度稳定性、容重、pH 值曲线特性及体内水解效率等，其中酶活含量是最重要的质量指标。饲用植酸酶酶活性的定量分析至今没有普遍公认的检测方法,在参考了 AOAC 方法的基础上采用分光光度法测定饲用植酸酶活性。酶活性对反应条件十分敏感，测定条件和测定程序的不同对结果有极大的影响。一 个 植 酸 酶 活 性 单 位 U定义“在温度为 37 ℃、pH 值 5.5 的条件下，每分钟从植酸钠浓度为 5.0 mmol/l 植酸钠溶液中释放1 μmol 无 机 磷，仪器试剂 植酸酶（Sigma公司）、钼酸铵、钒酸铵、稀硝酸、植酸钠、乙酸钠均为分析纯。主要设备超净工作台，721型分光光度计，PHS-3TC型精密数显酸度计，80-2型离心沉淀器。实验步骤 无机磷测定方法： 准确称取0.6804g在105℃烘至恒重的基准磷酸二氢钾于100mL容量瓶中，用乙酸缓冲液溶解，并定容至100mL，浓度为50.0mmol/L，加显色液显色，以无机磷浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，在波长415nm处测定吸光度值。 植酸酶活性测定方法： 发酵液经3000r/min离心去除菌体，上清液利用截留分子量为10000U的透析袋在去离子水中透析2h得到去除无机磷的酶液，将酶液用pH5.5的乙酸钠缓冲液稀释至合适浓度，取1mL于37℃预热5 min。然后加入2倍体积的5mmol/L植酸 钠溶液，37℃恒温反应15min后 立 即 加 入2mL颜色终止液。室温条件下静置10min后于3000r/min离心10min。空白对照是将酶液和终止液37℃温浴15min后再加入底物植酸钠。结果与讨论1. 同一底物的不同酸碱度对植酸酶活性影响的试验方法 在 37 ℃ 的试验条件下， 改变底物植酸钠（P8810）pH ，测定酶促反应的初速度。以pH为横坐标，A为纵坐标作图表 1 同一底物的不同酸碱度对植酸酶活性的影响pH2.22.83.64.8 55.87.28.29.1A171276194198110786653图1 同一底物的不同酸碱度对植酸酶活性的影响从图表可以看出，酶活性与pH有关。不同的pH溶液中酶活性不同 。其中过酸或过碱抑制酶活，最适PH在6左右。2. 不同离子对植酸酶活性影响的试验方法 在 37 ℃、pH 5.5 的试验条件下， 改变溶液中离子的种类，测定反应液的吸光度A。以离子I为横坐标，A为纵坐标作图。表 2 不同离子对植酸酶活性影响INonKMgCaNaZnCuA1271261241981462130图2 不同离子对植酸酶活性影响从图表可以看出，酶活性与离子的浓度有关。不同的离子溶液中酶活性不同 。其中锌和铜抑制酶活，钙和镁促进酶活。3. 不同温度对植酸酶活性影响的试验方法 在 pH 5.5 的试验条件下， 改变反应温度，测定反应液的吸光度A。以温度T为横坐标，A为纵坐标作图。表 3 不同温度对植酸酶活性影响T10303037455565A408412618642014092图3 不同温度对植酸酶活性影响从图表可以看出，酶反应活性与温度有关。低温和高温都会抑制酶活性。酶的最适反应温度在45度左右。4 同一底物浓度对植酸酶活性影响的试验方法 在 37 ℃、pH 5.5 的试验条件下， 改变底物植酸钠（P8810）浓度，测定酶促反应的初速度。取两者的倒数分别为横纵坐标作图表 4 同一底物对不同酶活水平植酸酶酶活检测的影响1/[S]11.536124.71/[v]4.44.66.18.113.87,4图4 同一底物对不同酶活水平植酸酶酶活检测的影响从图表可以看出，底物浓度的倒数与酶反应初速度成正相关。 较低的底物浓度不能使植酸酶完全催化， 但较高的底物浓度对植酸酶的催化活性也有抑制作用。5.不同37°Chr对植酸酶活性影响的试验方法 在 37 ℃、 pH 5.5 的试验条件下， 改变Chr，测定酶促反应的初速度。以37°Chr为横坐标，A为纵坐标作图。表 5同一底物不同37°Chr对植酸酶酶活检测的影响37℃hr0.512346A128180276344400488图 5同一底物不同37°Chr同对植酸酶酶活检测的影响从图表可以看出，底Chr与酶活成正相关。 当Chr接近无穷大时，酶活有最大值。 6.离子浓度对酶活性影响的试验方法 在 37 ℃、 pH 5.5 的试验条件下， 改变Cu和Zn的浓度，测定酶促反应的Con。表 6离子浓度对酶活性影响图 6离子浓度对酶活性影响从图表可以看出，不同的离子浓度对酶活性的影响程度不同。