微生物实验一概念.docVIP

北 方 民 族 大 学 学 生 实 验 报 告 院（部） 生物科学与工程学院 姓 名 学 号 专 业 生物工程 班 级 同组人员 课程名称 微生物学类实验 实验名称 产酶微生物的分离、纯化与选育 实验日期 2013.11 批阅日期 成 绩 教师签字 北方民族大学教务处制 产酶微生物的分离、纯化与选育 实验意义： 酶是生物体内进行生物化学反应的催化剂，在生物体中已发现的酶有2500多种。由于酶促反应的特异性强，反应温和，安全无毒，环境污染少，在洗涤剂、皮革、纺织、诊断、制药等领域具有广泛的应用价值。能由工业生产的50多种酶制剂蛋白酶、淀粉酶等，大部分是由霉菌、细菌、链霉菌和酵母菌生产的。通过本实验，学会从自然界中分离产酶微生物的方法，军中的纯化技术及其高产菌的选育技术。 蛋白酶产生菌的分离与纯化 1.1实验目的：学习从自然界中分离蛋白酶产生菌并纯化。 1.2实验原理 许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌。本实验将土壤样品（或其他样品）悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到酪蛋白平板进行培养，根据酪蛋白平板的水解圈作初筛。也可直接将细菌或霉菌接种到酪蛋白平板进行培养，分离筛选其他蛋白酶产生菌。 1.3实验仪器与材料 土壤样品或其他富含蛋白质的样品、牛肉膏蛋白胨培养基平板、酪蛋白平板、无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液；显微镜、恒温水浴锅、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒等。 1.4实验方法与步骤 1.4.1配制酪素培养基：牛肉膏0.3g、NaCl 0.5g，酪素 1.0g，琼脂 2.0g，蒸馏水100mL左右， 调节pH 7.6-8.0。 1.4.1.1配制方法：称取酪素1g，先用少量2%NaOH润湿，玻璃棒搅动，再加适量的蒸馏水，在沸水浴中加热并搅拌，至完全溶解，补足水量至100mL，加入其他成分，调整pH值，灭菌备用。 1.4.2配制土壤样品： 采集土壤样品，用无菌水制备1：10土壤悬液。 取1：10土壤悬液5ml，然后将悬液按10-1、10-2、10-3、10-4梯度稀释，注入试管中。 3）将这些试管放入75-80 ℃水浴中热处理10 min，以杀死非芽孢细菌。 1.4.3灭菌与接种： 将培养基灭菌处理。 取加热处理过的土壤悬液100-200 μL，涂布接种到酪素培养基平板，将平板倒置，于30-32 ℃培养24-48 h。 1.4.4.蛋白酶产生菌的纯化： 1）根据酪蛋白平板的水解圈作初筛，挑选出单菌落的蛋白酶产生菌。 2）将挑选出的单菌落用平板划线法接种到牛肉膏蛋白胨培养基上，然后将平板倒置放于培养箱中24—48h。 1.4.5芽孢杆菌的染色判断 1）涂片固定。2）滴加滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。3）用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但勿沸腾，切忌使染液蒸干，必要时可添加少许染液4）倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色为止。5）用番红水溶液复染1分钟，水洗至水为无色。6）待干燥后，置油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色产酶微生物菌种的选育 生物的遗传信息的改变是通过基因突变、基因重组和基因转移来进行的。基因突变，又称点突变（point mutation），包括自发突变和诱发突变，前者是未经人为施加诱变剂处理而发生的突变，后者是经人为施加诱变剂处理而获得的突变。两种突变都是由于一个或几个碱基的增加、缺失或置换而引起的，因此本质相同，不同的只是诱发突变的频率比自发突变的频率要高得多。这一部分的实验是以紫外线为例介绍了物理因素对微生物的诱变作用。本实验中，学生将筛选出的蛋白酶的产生菌株作为出发菌株通过紫外线即物理因素对微生物的诱变作用，对以上菌株进行选育工作。特以酶产生菌株作为出发菌株，经过紫外线的诱变作用，根据透明圈直径与菌落直径的比值，可初步确定酶的高产菌株为例来介绍本实验内容。.1 实验目的 通过实验观察紫外线和亚硝基胍等理化因素对微生物的诱变效应，并掌握基本方法。 .2 实验原理 基因突变可分为自发突变和诱发突变。许多物理因素、化学因素和生物因素对微生物都有诱变作用，这些能使突变率提高到自发突变水平以上的因素称为诱变剂。 紫外线（UV）是一种最常用的物理诱变因素。它的主要作用是使DN