《苯生态修复研究结题报告》.docx

摘要目前，苯酚作为重要的化工生产原料，正以每年百万吨的数量被制造出来。由于苯酚有毒，且结构稳定，不易分解，因此对人体和环境都有很大的危害。而生物降解因具有经济、高效、无二次污染等，逐渐成为当下解决苯酚污染的主要方法。本课题意图通过筛选具有不同降解途径的微生物菌株，利用多位点降解菌系建立高效率的苯酚污染物的降解过程，为环境污染的生态修复提供创新的手段。主要结论如下：1.通过对化工厂周围污水的分离纯化、生理生化实验和降酚性能的测试得到三株菌株CZL-1、CZL-2、 CZL-3，经鉴定均为假单胞菌。2.利用亲水性高聚合度聚乙二醇（PEG6000）在高盐度溶液中沉淀夹带苯酚降解菌发酵液中的微量酶蛋白，再在磷酸盐溶液复溶解过程中形成双水相萃取体系，以回收高纯度邻苯二酚1，2-双加氧酶。3.运用生物统计学的方法，借助于正交实验、Plackett-Burman 实验、Box-Behnken 中心组合实验，筛选出接种量CZL-1（0.5%）、CZL-2（0.5%）、CZL-3（1.0%）组合成的混合菌液具有较为理想的降解效果。优化后苯酚的降解率达到97.87%，与优化前91.78%降解率高出6.09%。优化组合实验有效地提高了苯酚的降解效率，为含苯酚废水处理技术提供参考。关键词：苯酚，降解，多位点，双水相萃取，生物统计法引言目前，苯酚产品正以每年百万吨的数量被制造出来，广泛用于石油、化工、农药、电子、纺织、造纸、化妆品及制药等工业生产过程。由于苯酚结构稳定，不易分解，又具有相当大的致畸、致突变和致癌作用，因此对环境和人体的危害极大。近年来的研究表明，微生物降解苯酚污染物具有降解速率快，转化率高，矿化度高，处理浓度高和无二次污染等优点，已成为最有发展前途的治理环境污染的方法。资料表明苯酚化合物的生物降解途径基本上是一致的，大体上有两条途径：2,3-位加氧途径和3,4-位加氧途径，其中以前者居多。其降解的重要位点为双加氧酶或单加氧酶攻击苯环形成邻苯二酚，再通过邻苯二酚间位或邻位双加氧酶开环形成粘康酸半醛或粘康酸，最后进入三羧酸途径彻底氧化。多位点降解作用既是苯酚降解方式，也是苯酚降解的调速手段。本课题意图通过筛选具有不同降解途径的微生物菌株，利用多位点降解菌系建立高效率的苯酚污染物的降解过程，为环境污染的生态修复提供创新的手段。研究方法与过程我们的研究内容有以下几点：1、从含苯酚物质驯化的污泥中分离出多株微生物菌株；测定不同纯种菌株各自苯酚的降解特性，筛选不同降解途径的微生物；3、依据降解机理、耐受浓度、挂膜性能及生态互补等原则建立高效协同的苯酚污染物质的生物降解体系；4、复合菌系应用到生化反应器完成降解特征测试，建立起一种新型的苯酚污染物质的生物降解工艺。我们的实验步骤如下：1、降解微生物的分离（1）选择性富集培养 选择性苯酚物质筛选培养基为富集培养液，富集条件装瓶量：50mL/250mL三角瓶； 培养条件：30℃，200rpm，培养周期：24-36h后补加苯酚或三氯苯酚至0.3g/L，相同条件下重复增殖3次。（2）菌株分离 利用不同苯酚物质交叉筛选，纯化出多种菌株，记录各种情况下的菌落出现情形，分析同种菌株出现的重复性，寻找差异性筛选条件下出现的不同类菌株的规律，分析分离菌株中存在的不同降解途径的微生物，并对菌株降解性能作定量测试。2、菌株生物降解酶系分析 （1）饥饿状态细胞的制备；（2）苯酚对菌株的诱导；（3）邻苯二酚1，2-双加氧酶及邻苯二酚2，3-双加氧酶活性的测定；（4）酶学性质测定（Km等），鉴别不同菌株的酶系差别；（5）苯酚生物降解机理的探讨。3、实验菌株的鉴定 （1）形态鉴定；（2）生理生化鉴定；参照微生物学实验指导及菌种鉴定手册。4、多位点菌株降解能力组合设计 运用Minitab软件设计响应面分析法优化菌群组合的实验，设定相关条件为因素，以苯酚降解率和矿化度等为响应指标，优化出最佳的菌株组合参数，并通过实验验证组合菌株的降解性能。5、复合菌群降解性能实验 (1)菌系在含苯酚状态下的生长曲线测定；(2)温度对苯酚的生物降解性能的影响；(3)pH对苯酚的生物降解性能的影响； (4)苯酚浓度对生物降解性能的影响；(5)菌体浓度对苯酚的生物降解性能的影响；(6)摇床转速对苯酚或三氯苯酚的生物降解性能的影响；(7)共代谢物质添加对苯酚的生物降解性能的影响；(8)盐浓度对苯酚的生物降解性能的影响。研究结论与成果1、共代谢驯化基质对苯酚降解菌株的分离及性质研究以污水处理厂的活性污泥作为实验样本通过富集、驯化、分离、纯化步骤分离出CLZ-1、CZL-2、CZL-3三株具有苯酚降解的菌株。其在固体培养基的上的形态描述如表1表1菌株在固体培养基上的菌落形态描述菌株标号菌落描述CZL-1白色、圆形、较大、边缘较光滑、不透明、湿润、稍隆起CZL-2