《镉重金属对野生稻与栽培稻杂交选育后代种子萌发》.doc

前言 实验设计的思路是参照《水稻_OryzasativaL__省略_的重金属毒害与耐性的分子机理研究_葛才林》博士论文的研究框架与结果，如下图所示。实验选择测定的物质有：糖类代谢： 淀粉酶活性与同工酶测定、苹果酸脱氢酶、细胞色素氧化同工酶分析、甘露聚糖酶、蔗糖酶活性检测。蛋白质代谢：谷胱甘肽含量测定、蛋白酶活性测定、镉诱导蛋白合成分析。脂类代谢：丙二醛测定、酯酶测定分析、脂氧合酶同工酶分析。抗氧酶检测：POD过氧化物酶、SOD超氧物歧化酶、同工酶检测。 《镉重金属对野生稻与栽培稻杂交选育后代种子萌发、幼苗形态 建立的生理影响研究实验设计》 从基础物质代谢（糖类代谢、蛋白代谢、脂类代谢）、抗氧化机制两大方面进行实验设计。 基础物质代谢 1、糖类代谢 （1）水稻主要储藏物质代谢：淀粉 淀粉酶活性与同工酶测定【1】 【实验结果文献参考】 实验设计：淀粉酶活性的测定?一、原理?淀粉酶能将淀粉水解成麦芽糖，由于麦芽糖能将3，5-二硝基水杨酸试剂还原成3-氨基-5-硝基水杨酸的橙红色化合物，且在一定范围内还原糖的浓度与反应液的颜色成正比，故利用比色法可求出麦芽糖的含量。以5分钟内每克样品水解产生麦芽糖的毫克数表示酶活性的大小。?植物淀粉酶可分为α-淀粉酶和β-淀粉酶两种，其中β-淀粉酶不耐热，在温度70℃以上易钝化：而α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下则发生钝化。根据以上特性，可分别测定这两种淀粉酶的活性。如测定α-淀粉酶和β-淀粉酶的活性，即为淀粉酶总活性。?二、实验材料、 仪器 及试剂?1． 仪器 ：?20ml具塞试管 移液管 100ml容量瓶 石英砂 研钵?721型分光光度计 离心机 恒温水箱 离心管?2． 试剂 ：?（1）1%淀粉溶液：称1.0克可溶性淀粉，加入100ml蒸馏水煮沸。（临用时配制）?（2）pH5.6柠檬酸缓冲液：A、称取柠檬酸21.0克，溶解后定容至1000ml；B、称取柠檬酸钠29.4克，溶解后定容至1000ml；量取A液55ml与B液145ml混匀，即为pH5.6的缓冲液。?（3）0.4mol/L氢氧化钠溶液。?（4）3,5-二硝基水杨酸 试剂 ：取1.0克3,5-二硝基水杨酸，溶于20ml mol/L氢氧化钠中，加入50ml蒸馏水，再加入30克酒石酸钾钠，待溶解后，用蒸馏水稀释至100ml，盖紧瓶盖，勿使二氧化碳进入。?（5）麦芽糖标准溶液：称取0.1000克麦芽糖，溶于少量蒸馏水中，然后定容至100ml，取为1mg/ml麦芽糖标准液。实验材料：萌发水稻种子。?三、实验方法?1．酶液的制备：称取去根萌发水稻种子2克（含外壳），置研钵中，加1克石英沙研磨成匀浆。用8ml蒸馏水分次洗涤研钵，将匀浆转入 离心管 中，搅拌均匀后放置15～20分钟（间隔搅拌2～3次）。3500rpm离心10分钟，将上清液转入100ml容量瓶，用蒸馏水定容至刻度，得粗酶液。?2．α淀粉酶与β-淀粉酶的酶促反应：?取4支10ml具塞刻度 试管 ，编号，按下表加入各液：??将以上各管混匀后，置40℃水浴准确保温5分钟，取出后立即向3、4号 试管 中加入4ml 0.4mol/L NaOH终止酶活性。?3．麦芽糖的测定：?（1）标准曲线制作：取20ml 刻度试管7 支，编号，分别加入1mg/ml 麦芽糖标准液0，0.2，0.6，1.0，1.4，1.8，2.0ml，然后各管加蒸馏水，使体积均达2ml，再向各管加3，5-二硝基水杨酸试剂2ml，置沸 水浴 中煮沸5分钟，取出后冷却，用蒸馏水稀释至20ml，摇匀后在520nm波长下用分光光度计比色，以光密度值为纵坐标，麦芽糖含量为横坐标绘制标准曲线。?（2）样品的测定：取以上酶作用后的反应液及对照管中的溶液各2ml，分别放入20ml具塞刻度试管中，加入2ml3，5-二硝基水杨酸试剂，置沸 水浴 中准确煮沸5分钟，取出冷却，用 蒸馏 水稀释至20ml，摇匀在520nm波长下用分光光度计比色，记录OD值，从麦芽糖曲线中查出相应麦芽糖含量，进行结果计算。?四、结果计算??A—为酶反应管中麦芽糖含量，即3，4号管中麦芽糖毫克数的平均值。?A′—为对照管中麦芽糖含量，即1，2号管中麦芽糖毫克数的平均值。 参考《现代植物生理学实验指南》 淀粉酶同工酶检测【2】 呼吸中的糖相关代谢：苹果酸脱氢酶 细胞色素氧化同工酶分析 （4）其他糖代谢检测 ： *参考《现代植物生理学实验指南》 #甘露聚糖酶（参考《植物激素对水稻种子萌发过程中_甘露聚糖酶活性的调控_任艳芳》