免疫组化小结年.pptVIP

免疫组织化学技术方法小结 倪灿荣 一、免疫组织化学根据示踪物不同，可构成不同的免疫组化方法 1.荧光素----免疫荧光组化技术 直接法 间接法 LsAB法 2.酶(HRP-AKP)-----免疫酶组化技术 直接法、间接法、桥法、PAP法、双PAP法、APAAP法、Epos法、EnVision法、UIP法、PicTureTMplus法、ABC法、S-P法 3.金—IGSS、IGS 组织抗原 第一抗体 过氧化物酶 直接法 组织抗原 第一抗原 第二抗体 过氧化物酶 间接法 酶桥法 组织抗原 第一抗体 第二抗体 第三抗体（抗酶抗体） HRP 组织抗原 第一抗原 第二抗体 PAP复合物 PAP法 HRP 组织抗原 第一抗原 第二抗体 PAP复合物 双PAP法 HRP APAAP法 多聚螯和物酶法 Epos法 ? EnVision法 ? UIP法 组织抗原 一抗 HRP 多聚骨架 EPOS 方法 组织抗原 一抗 二抗 酶 多聚骨架 第一步 第二步 EnVisionTM方法 3.亲和细胞化学方法----生物素和卵白素 ABC法、LsAB法(S-P法)、CSA法 组织抗原 第一抗体 第二抗体 HRP 生物素 卵白素 ABC法 LSAB法 ABC法与S-P法的特点和区别点 特点 1.均为亲和细胞化学方法； 2.生物素化二抗与特异性一抗结合； 3.亲和素(Avidin)与生物素(Boitin)结合； 4.亲和素与链霉亲和素(Streptavidin)均有四个结合位点,其中三个位点与酶(HRP和AKP)结合,一个位点与生物素结合。 ABC法与S-P法的特点和区别点 区别点 1. ABC(SABC)法将酶标记在生物素(Bi-HRP)上,而S-P法将酶直接标记在链霉亲和素上(四个位点中的三个标记上酶分子)； 2.应用时ABC法应在30min前将avidin与bio-HRP等量混合，而S-P法不需耍。 问题 1.免疫组化直接法、间接法、桥法与PAP法的共同点和不同点？ 2.PAP法、ABC法、EnVision法的共同点和不同点？ 3.免疫荧光组化法、免疫酶组化法和免疫金银组化方法间的共同点和不同点？ 4.PAP法、ABC法、EnVision法和IGSS法的共同点和不同点？ 5.S-P法与CSA法的共同点和不同点？ CSA法原理图 4.金-------免疫胶体金法 IGS法、IGSS法 5.铁-------免疫胶体铁法 二、与其他技术相结合的免疫组化方法 RCA法 PCR-免疫组化方法 滚动式循环放大（Rolling Circle Amplification）法 RCA是一种能够在恒温条件下，使标记在抗体上的寡核苷酸，在DNA聚合酶的作用下，加入互补并标记有示踪物的寡核苷酸，随着扩增循环的进行，将大量的示踪物沉淀在抗原抗体复合物的周围，或杂交分子周围，再通过IHC方法再放大示踪物。 原位免疫PCR Sano等（1992）率先利用基因工程的方法表达了蛋白A与链霉亲和素的嵌合体分子获得成功，建立了免疫PCR技术,一种新的抗原检测系统，随后在免疫PCR的基础上，建立了在细胞或组织原位检测抗原的原位免疫PCR（in situ immuno-PCR）。 HRP呈色反应原理 HRP+H2O2 HRP.H2O2+供氢体(电子供体) HRP+H2O+供氢体(氧化型) 氧化、环化 吲哚胺多聚体 苯乙肼聚合体 氧化、环化 HRP特异底物为H2O2 ，在分解H2O2过程中，与H2O2形成初级复合物，无电子供体时，反应不再继续进行，当电子供体存在时，反应以一定的速度形成第二种复合物。 之后HRP催化H2O2已形成的中间型产物，迅速生成水，酶被还原，电子供体