WesternBlot详解及常见问题..docVIP

Western Blot详解 Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。该文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术。 Contents： （1） 原理 （2） 分类 i. 放射自显影 ii. 底物化学发光ECL iii. 底物荧光ECF iv. 底物DAB呈色 （3） 主要试剂 （4） 主要程序 （5） 实验常见的问题指南 1. 参考书推荐 2. 针对样品的常见问题 3. 抗体 4. 滤纸、胶和膜的问题 5. Marker的相关疑问 6. 染色的选择 7. 参照的疑问 8. 缓冲液配方的常见问题 9. 条件的摸索 10. 方法的介绍 11. 结果分析 （1） 原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目