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如何通过伽马辐射提高免疫测定灵敏度：抗HIV—1酶联免疫吸附测定中的聚苯乙烯表面的改性、应用及表征 摘要：经60CO γ—射线辐射的改性聚苯乙烯（PS）微量滴定板用于间接酶联免疫测定抗人类免疫缺陷病毒1型（抗HIV—1）。用9 kGy（最佳剂量）辐射过的板在血清学诊断试验中表现出比未处理组高2—5倍的检测灵敏度，并且比控制组低3倍的酶浓度仍是可检测的。吸附/解析实验结果、原子力显微镜（AFM）图像和X—射线光电子能谱（XPS）分析为这种性能提升提供了证据。在辐射期间形成的氧化表面对包被抗原呈现出更高的结合亲和力，并能均匀地吸附更大量（1.5—3倍）的蛋白质。 关键字：ELISA，γ—射线辐射，HIV—1，聚苯乙烯表面，蛋白吸附 前言 PS微量滴定板常作为酶联免疫吸附测定（ELISA）中蛋白质吸附的固相载体，现在作为一种成熟的技术已被广泛应用于生物科学和医学实验室诊断。由于这种检测方法是基于固相免疫反应，所以生物活性化合物对板的吸附是非常重要的。然而，由于小分子几乎没有结合位点，所以低分子量的抗原/抗体很难通过随机吸附固定在PS表面。 PS表面和小分子蛋白的弱相互作用限制了ELISA测定法的灵敏度。通常，在PS表面这种类型的固定要涉及共价偶联步骤，因蛋白质不适当的构象呈递和定向，这是耗时的并且可能改变抗原表位。为了保持它们的构象和生物活性，不同的方法，如生物素—链霉抗生素蛋白桥和亲和配体已被用于定向固定化。在这项研究中，我们用一定剂量的60CO γ—射线辐射了PS微量滴定板，并将这改性的板用于低分子量的HIV—1重组抗原（分子量：32kDa）的吸附。我们通过在一个典型的间接ELISA测定系统中检测抗HIV—1评估了辐射对PS板的性能效果。此外，吸附/解析实验、AFM和XPS被用来进一步研究蛋白质在PS表面的吸附。 试验 辐射处理 在3 m3/min 的空气流速下，PS 96孔微量滴定板（Nunc，丹麦）被60CO源（福建农业科学研究院，中国）在剂量率为1 kGy/h下，分别以0、3、6、9、12、15 kGy的水平进行辐射。 ELISA研究步骤 在辐射之后，用pH为7.2，10 mL的磷酸缓冲液（PBS）稀释HIV—1重组抗原（gp 120—gp41，贾大勇博士友情提供），然后以100 uL/孔加入ELISA平板中，在4 °C过夜（这个过程通常为包被）。接着，用含0.05%（v/v）的Tween—20的PBS溶液洗涤板，并用封闭剂（含2.5 mg/mL BSA的PBS）在37 °C下封闭2 h。在板的每个孔中加入100 uL稀释的血清样品（含有抗HIV—1抗体的阳性样品，来自全国临床检验中心，中国）。在37 °C下经过0.5 h的孵育后将板洗涤，然后加入适宜浓度的辣根过氧化物酶偶联羊抗人IgG（HRP—IgG，Sigma，美国），接着再培养0.5 h。各孔再次洗涤以除去任何未结合的轭合物，接着再加四甲基联苯胺（Sigma，美国）培养15 min。加入50 uL的2 mol/L的硫酸终止比色反应，用550酶标仪（Bio—Rad，美国）在450 nm处检测吸光值。所有实验重复4次，以吸光值（OD450nm）的算术平均值计算。 解析实验 在每个包被孔中加入100 uL的pH为7,100 mmol/L KNO3溶液，在37 °C下剧烈振动孵育2 h。收集该溶液后，解析的HIV—1抗原量由溶液中蛋白质浓度来确定。解析实验用99 mmol/L KNO3—1 mmol/L HNO3溶液（pH值为3）和90 mmol/L KNO3—10 mmol/L KOH溶液（pH值为12）重复进行。使用微BCA蛋白检测试剂盒（Pierce，美国）测定蛋白质浓度。 AFM和XPS 在封闭之前，包被板的孔底可用AFM和XPS测量。AFM用的是接触式Nanoscope Шa型多模式扫描探针显微镜（数字化仪，美国）。XPS测定是用SSX—100分光仪（表面科学仪器，美国）结合单色化的AlKα X射线源（能量为1486.6 eV）在150 W条件下运行。 结果与讨论 免疫测定特性 各种剂量辐射的效果通过ELISA灵敏度进行评估。表1表明吸光度值随着辐射剂量的增加而逐渐增加，最大辐射剂量为9 kGy，更大剂量的辐射会让吸光值降低到一定程度。与未处理组相比，经9 kGy辐射的板在抗HIV—1系列稀释液（4—46倍）中（图1a）或包被浓度的一个宽的范围内（0.1—1000 ug/mL）（图1b）都表现出2—5倍更高的检测灵敏度。表1示出使用经9 kGy 辐射过的板ELISA的信噪比（信噪比，阳性样本吸光度的平均值与阴性样本吸光度的平均值的差值除以阴性样本吸光度值得到的百分比）高达25.9，比控