细胞培养概述—左琳.pptVIP

细胞培养概述 主讲人：左琳 细胞培养的条件 环境条件 1、进入培养室前要至少打开紫外灯照射30min 2、细胞室每周隔两三天打扫卫生，用0.2％的新洁而灭拖洗地面并擦拭实验室内各仪器表面。门把手等常易潜藏细菌的地方用75％酒精喷洒抑菌。 3、恒温水浴振荡器内的水每隔大约一周（水不澄清）更换一次，加两支硫酸庆大霉素。 4、培养箱托盘内的水定期更换，保证无菌。 超净工作台 1、使用前以70 % ethanol 擦拭无菌操作台面并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。 2、每次操作只处理一株细胞，以避免失误混淆或细胞间污染。 3、实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70%ethanol 擦拭无菌操作抬面。 4、工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线，降低消毒效果。 培养条件 ★ 气体环境：95％空气加5％CO2混和气体 环境中。 ★ PH值：7.2～7.4 ★ 温度：37℃ 培养用具的处理 1.清洗和浸泡: (1)玻璃器皿:新的玻璃器皿在生产过程中常使玻璃表面呈碱性，并带有一些如铅和砷等对细胞有毒的物质，使用前必须彻底清洗。首先用自来水初步刷洗，在5％稀盐酸溶液中浸泡过夜。然后用流水彻底冲洗3-5遍，单蒸馏水漂洗3遍，三（双）蒸水漂洗2遍，烘干备用。 （2）塑料器皿:塑料器皿经冲净后，晾干，用2％NaOH浸泡过夜，自来水冲洗干净，流水彻底冲洗3-5遍，单蒸馏水漂洗3遍，三（双）蒸水漂洗2遍，烘干备用。 注意：离心管等灭菌后在超净台内取出使用时应该立即将螺旋旋紧；EP管等可至于铝制饭盒内，表面以多层纱布覆盖，亦不可开口暴露在外，以减少污染的机会。 2.包装： 在消毒前必须进行严格包装，以便消毒及储存，防止落入灰尘及消毒后再次被污染。包装纸（盒）表面用油性记号笔标明物品名称、消毒日期等。 3.灭菌： 高压蒸汽灭菌锅灭菌三十分钟，取出烘干。 细胞的传代培养 1.小心倾出旧培养液，用2~3mlPBS清洗两遍，加入适量消化液（胰蛋白酶液）。注意：消化液的量以盖住细胞最好，最见效温度为37℃。 2.倒置显微镜下观察细胞，若细胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。 3.倾去消化液，加入一定量的培养液，用刻度吸管将已经消化的细胞吹打成细胞悬液。 4.将细胞悬液吸出分装至若干个培养瓶中，补加适量培养液，旋紧瓶盖，放入培养箱培养。 注意事项： 1.适度消化：消化不好细胞不能吹打下来形成悬液，消化太过细胞会脱落损失，若过多脱落则需离心，对细胞的伤害比较大。 2.吹打时要注意刻度吸管不要划伤细胞，吹打动作要轻，避免产生过多的气泡。 3.处理细胞比较多时，要保持头脑清晰，把PBS、培养液、吹打用的刻度吸管区分开，避免交叉污染。 4.传代前后注意用显微镜观察细胞的状态和数量，做好记录。 细胞的冻存 1.按常规方法消化处于对数生长期的细胞培养物，制备单细胞悬液，并计算细胞总数； 2.将细胞悬液以800~1000r/min离心5min，去上清液； 3.向细胞沉淀物中加入冷冻保护液，轻轻吹打混匀，使细胞密度达1×106~ 1×107个/ml 4.按每管1~1.5ml的量分装于冻存管内，拧紧管盖； 5.在冻存管上做好标记，包括细胞代号及冻存日期。 1.先将冻存管放入普通冰箱冷藏室（4~8℃），约40min； 2.接着将冻存管置于普通冰箱冻存室（-10℃~-20℃），约 30~60min； 3.将冻存管转入低温冰箱（-30℃），放置30min左右； 4.然后将冻存管转移到超低温冰箱（ -70℃~-80℃ ），过夜； 5.最后将冻存管投入液氮保存 注意事项： 1.冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情 形。 2.配制冷冻保存溶液(使用前配制)：将DMSO 加入新鲜培养基中，最后浓度为5-10％，混合均匀，置于室温下待用。（原液︰血清︰ DMSO=6 ︰ 3︰ 1配完后过0.22μm微孔滤膜） 3.温度逐渐降低，不可快速过渡 细胞的复苏 1.自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。 2. 将新鲜培养基置于37 °C 水槽中回温，回温后喷以70 % 酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。 3. 取出冷冻管，立即放入37 °C 水槽中快速解冻，轻摇冻存管使其在1分钟内全部融化，以75% 酒精擦拭冻存管外部，移入无菌操作台内。 4. 取出细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例1:10～1:15)，混合均匀，放入CO2 培养箱培养。  解冻后是否立即去除冷冻保护剂(DMSO):依细胞种类而异，一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。若要立即去除，则将解冻之细胞悬浮液加入含有5