2015-2016学年53《血红蛋白的提取和分离》课件.pptx

金太阳好教育云平台 专题5 DNA和蛋白质技术 课题3 血红蛋白的提取和分离血红蛋白的组成β βα α血红素基因可携带一分子O2或一分子CO2一、基础知识蛋白质提取与分离的依据－－ 蛋白质的物理化学性质差异1.分子的形状、大小2.电荷性质和多少3.溶解度 4.吸附性质5.对其他分子亲和力 血红蛋白的提取和分离1.方法及原理方法原理凝胶色谱法根据相对分子质量的大小分离蛋白质电泳法各种分子带电性质的差异以及分子本身大小、形状的不同凝胶色谱法1.概念：根据被分离物质（如蛋白质）相对分子质量的大小，利用具有多孔网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。性质：微小的多孔球体本质：多糖类化合物实例：葡聚糖、琼脂糖2.原理：当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。 洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液， 促使蛋白质分子的差速流动。混合物上柱洗脱大分子流动快小分子流动慢收集大分子收集小分子 相对分子质量大小直径大小大于凝胶颗粒孔道直径小于凝胶颗粒孔道直径运动路径被阻挡在凝胶颗粒外面而迅速通过因扩散进入凝胶颗粒内部而被滞留运动速度较快较慢运动路程较短较长洗脱次序先后缓冲溶液1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的溶液。2、作用：能够抵制外界的酸或碱的对溶液的pH的影响，维持pH基本不变。3、配制：通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。还记得人体血液中的缓冲液吗？H2CO3 /NaHCO3 NaH2PO4 /Na2HPO4 你认为在血红蛋白整个实验中用的缓冲液是什么？目的是什么？ 本实验使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的pH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和科学研究（活性）。 （三） 电泳：1.概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。2.原理： ①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。3.类型:琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。 血液组成成分 1.洗 涤 红 细 胞 2.释放血红蛋白 3.分离血红蛋白 4.透析血红蛋白二、实验操作－－实验步骤样品处理和粗分离 1.提问：用鸡的红细胞提取DNA，用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？ 鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。血红蛋白2.提问：血液有哪些成分？血红蛋白（90％） 水分 血浆 固体物质血液 白细胞 血细胞 血小板 红细胞红细胞搅拌10min红细胞1.洗涤红细胞阅读思考：洗涤的目的是什么？洗涤的方法是什么？ 洗涤干净的标志是什么？血液100mL重复洗涤3次，直至上清液没有黄色5倍体积生理盐水血 浆3g柠檬酸钠吸出血浆低速离心2 min2.释放血红蛋白阅读思考：释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？为了加速释放过程，采取了什么措施？目的分析：蒸馏水的作用是______________________________。加入甲苯的作用是____________________________。充分搅拌的目的是____________________________。使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂高速离心10min 离心管3.分离血红蛋白分离过程红细胞混合液脂类物质有机溶剂血红蛋白滤纸过滤烧杯1mL1mL1mL20mmol/L磷酸缓冲液4.透析血红蛋白透析的目的是什么？去除血红蛋白中的小分子杂质纯化－－凝胶色谱操作1.凝胶色谱柱的制作：教材图5－192.凝胶色谱柱的装填：3.样品的加入和洗脱材料：交联葡聚糖凝胶G-75 20mmol/L磷酸缓冲液“G”表示什么？75代表什么？步骤操作要求①②③④⑤固定色谱柱色谱柱垂直固定在支架上根据色谱柱体积计算凝胶用量计算称量凝胶配制悬浮液凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀装填悬浮液一次性缓慢倒入；轻轻敲打立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h洗涤平衡色谱柱内不能有气泡；装完后，立即用缓冲液洗涤，平衡凝胶使凝胶装填紧密。（3）样品加入与洗脱 ①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。 ②滴加透析