细胞生物学14第十四章细胞工程上课ppt课件.ppt

二. 基因工程动物的产生 基因工程动物 转基因动物 （transgenic animal） 基因剔除动物 （gene knockout animal） 1、疾病动物模型 目前已有多种遗传疾病的模型小鼠，是研究人类疾病的有利工具。 2、动物生物反应器（bioreactor） 主要用于生产目的蛋白质，如：乳腺生物反应器 3、人类移植用器官 通过遗传改造减少排斥。 三. 基于细胞的组织工程 组织工程皮肤 组织工程膀胱 将体外培养的功能细胞植入患者体内，以代偿病变细胞所丧失的功能。 还可先将体外细胞进行遗传修饰，再用于治疗 四. 细胞治疗 （一）细胞替代 1、神经系统疾病：如帕金森综合症 2、肿瘤：造血干细胞移植 3、其他疾病：烧伤、糖尿病、心脏损伤等。 （二）基于工程学细胞的基因治疗 思考题： 简要叙述单克隆抗体制备流程。 思考题 名词解释： 细胞工程 单克隆抗体 细胞核移植 第十四章 细胞工程 细胞工程（cell engineering）:也称细胞技术。指在细胞水平上，采用细胞生物学、发育生物学、遗传学及分子生物学等学科的理论与方法，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得具有产业化价值的细胞相关产品的一门综合技术体系. 广义细胞工程 微生物细胞工程 植物细胞工程 动物细胞工程 第一节 主要相关技术 基因操作 细胞的遗传修饰 细胞的表型分析 工程化细胞的应用 1）微载体（microcarrier） 基质材料：交联葡聚糖 1g 交联葡聚糖提供 6000cm2 附着面积 微载体是大规模培养方法中最有使用价值的支持物。 一、 动物细胞大规模培养技术 (一)基本策略 1.增加培养容积 2.增加细胞的附着面积 2）中空纤维（hollow fiber） 管壁半透性，细胞附于管外壁，管内可供培养液通过。 有利于分泌型表达蛋白的纯化，但不易放大培养。 3）微胶囊（microcapsule） 半透性膜囊，细胞长于内壁。微囊颗粒需要自行制备，无商业购买途径。 细胞密度大、产物在单位体积中浓度高、分离纯化简单。 3、抑制细胞的凋亡 在生产特定蛋白质（如疫苗、抗体等）的大规模细胞培养中宜用无血清培养： 避免血清中的蛋白质对目的蛋白纯化的影响。 延长G1期或促使细胞停于G0期，使细胞较长时间维持在高密度状态，利于产生更多目的产物。 降低细胞死亡率，避免死亡细胞的蛋白酶释放至培养基导致目的蛋白降解。 4、无血清培养： 延长G1期，或促使细胞停于G0期，细胞活力正常，可有效抑制凋亡。 （二）基本培养系统 传统悬浮培养系统：不锈钢发酵罐（高度：直径=1：1~ 3：1）和搅拌器，产生气泡易引起机械损伤。 旋转细胞培养系统：模拟失重状态，有效降低机械损伤，应用面广。 1. 悬浮培养系统 2. 气流驱动培养系统 主要优势在于简化设计，因为不需要搅拌器中的发动机和搅拌装置。 3. 微载体培养系统：微载体与搅拌悬浮培养相结合的培养系统。 4. 灌注培养系统：能自动地将“旧”的培养液排除，同时自动地将新的培养液以相同速率补入到细胞生长的容器中。 细胞的基本生长特征： （三）影响大规模细胞生长的因素： 潜伏期 对数生长期 平台期 优化大规模细胞培养的营养量化评估指标： 1）考虑细胞密度、生存能力、有丝分裂指数、一般形态及破碎数量的信息； 2）采用检测生化指标来判断。 葡萄糖和乳酸盐的浓度可以反映培养液的质量情况；乳酸脱氢酶可以判断细胞损伤或破碎情况。 利用显微注射装置，将一个细胞的核移植入另一个去核细胞中，已得到重组细胞。是克隆的关键技术。 二、 细胞核移植（nuclear transfer） （一）技术路线 1. 细胞质的选择： 受精卵、处于M II期的卵母细胞，可以使植入细胞核的基因组行为发生重编程（regrogramming），从而去分化恢复全能性状态。 2. 供核细胞的选择： 胚胎细胞、未分化的原始生殖细胞、胚胎干细胞、胎儿体细胞、成体体细胞。 分化程度 ，克隆效率 。 3. 去核： （1）紫外线照射去核 通过破坏DNA去核。损伤较大，基本弃用。 （2）盲吸法去核 依据M II期卵母细胞中第一极体与细胞核的对位关系，用去核针吸去第一极体及其附近胞质，成功率约80%。 （3）蔗糖高渗处理去核法 先经高渗蔗糖（0.3~0.9mol/L）处理，使核微凸，以去核针去除。 （4）透明带打孔去核法 先以显微针在透明带打孔，以细胞松弛素处理后去核，提高卵母细胞存活率。 （5）超速离心法 4. 重构胚的构建： 直接将供核细胞移植到 M II期卵母细胞/