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微生物分子生态学研究方法概述[摘要]对当前微生物分子生态学研究方法进行了总结和概括，介绍了微生物分子生态学的常用分析方法，包括寡核酸探针检测、DNA-DNA杂交、16SrRNA序列分析、编码蛋白质基因，并简要阐述了微生物分子生态学常用技术，包括RFLP、DGGE及Real-Time PCR。[关键词]微生物 分子生态学 RFLP DGGE Real-Time PCR[中图分类号] Q938.1 [文献码] B [文章编号] 1000-405X（2015）-2-267-10引言微生物分子生态学是利用分子生态技术手段研究微生物与环境之间相互关系及其相互作用规律的科学，主要研究微生物生态学基础理论问题。1微生物分子生态学常用分析方法1.1寡核苷酸探针检测该方法利用目标核酸序列与特异性探针特异性互补的特点，检测荧光标记的特定DNA序列[1]。探针为一段特定方式标记的核酸序列，具有较高灵敏度。做种群鉴定时选用DNA制备探针，利用cDNA避免繁琐的克隆程序，确保探针与种内全部菌株杂交。除此之外，cDNA探针若具有表型特异性，则可检测某一特定表型是否存在。1.2 DNA-DNA杂交DNA-DNA杂交针对微生物整体基因组的重组[1]，为检测DNA序列相似性提供可能性。该方法基于高温双链DNA解链、低温复性与碱基配对可转移的特点，通过温度等条件控制形成杂交DNA，检测其杂交率。由于来源不同的两条DNA单键难以配对重组，DNA杂交率可用于估计序列相似度。1.3 16SrRNA序列分析该方法在微生物分类学研究中最为常用[2]。微生物16SrRNA基因由保守区与可变区构成。可变区具有种属特异性，不同种属微生物间存在较大差异；保守区为所有微生物共有基因序列。微生物进化过程中，基因序列基本不变化，因此可根据保守区基因序列设计通用引物，或根据可变区基因序列设计特定引物，从而分析不同微生物的进化距离及亲缘关系。1.4 编码蛋白质基因该方法利用基因序列控制合成蛋白质[3]。微生物代谢过程实质为生物酶催化作用下的一系列氧化还原反应，而不同功能微生物的催化反应酶具有一定特异性，因此编码功能蛋白的基因不同，主要用于研究特定功能微生物，尤其在毒理学方面。2微生物分子生态学常用技术2.1限制性片段长度多态性分析（RFLP）在RFLP分析过程中，以所提取的微生物DNA为模版，利用特异性引物进行聚合酶链式反应（PCR）得微生物16SrRNA序列，将其连接到载体，转至大肠杆菌感受态细胞，通过挑取克隆子，进而获取质粒DNA来实现克隆文库构建。不同微生物DNA序列不同，进而酶切位点不同，因此利用特异性限制性内切酶消化，可得到长短不一、数目不同的限制性酶切片段，琼脂糖凝胶电泳分离得到呈现多态性的图谱，进而获取环境微生物群落结构信息[4]。2.2变性梯度凝胶电泳技术（DGGE）DGGE是一种检测DNA突变的电泳技术，根据DNA在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将碱基组成不同的DNA片段分开。该技术具有以下优点：①检测极限低、速度快；②结果准确可靠；③无需微生物的培养；④可同时检测多种微生物。但其存在以下局限性：无法获取样品中全部微生物DNA，而DNA回收率越低，重复性越低；不均等扩增造成结果代表性低；敏感度较低，采样和样品处理会对结果产生影响。2.3荧光定量PCR技术（Real-Time PCR）Real-Time PCR为微生物生态学研究的定量分析方法，通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，标记跟踪PCR产物，实时在线监测反应过程，结合相应的软件分析产物，计算模板浓度。该技术具有以下优点：①利用扩增产物数量与荧光信号强度成对应关系的原理，实时检测PCR反应进程，避免了终点定量重现性差；②自动化程度高，操作安全、简单，可避免产物被污染；③检测特异性强，灵敏度与精确度高；④可实现多重扩增。其缺点在于无法对不确定对象进行分析。3结论与展望微生物分子生态学克服了传统培养法的不足，为全面掌握微生物多样性提供了可能。若将各方法结合，以便掌握更为全面的信息，可更好揭示微生物对环境变化的影响，预示环境变化趋势，为从微观方面改善环境提供依据。参考文献[1]杨霞，陈陆，王川庆.16SrRNA基因序列分析技术在细菌分类中应用的研究进展[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2008，36（2）：55-60.[2]邓小宽，张新宜，田敏.现代生物技术在分子微生物生态学中的应用[J].国外医药（抗生素分册），2006，27（4）：164-170.[3]王晓丹，李艳红.分子生物学方法在水体微生物生态研究中的应用[J].微生物学通报，2007，34（4）：777-781.[4]王洪媛，管华诗，江晓路.微生物生态学中分子生物学方法及T-RFLP技术研究[J]. 中国生物工程杂志，2