医学微生物实验-革兰氏染色法幻灯片.pptVIP

革兰氏染色法 （Gram staining） 细菌微小、半透明，在普通光学显微镜下不易识别。 将细菌染色，增加反差，便于观察。 革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法。 革兰染色在临床上有助于细菌致病性分析及抗菌药物选择。 Hans Christian Gram * 实验原理 * 革兰染色法是基于细菌细胞壁成分和结构的不同，可将细菌分为革兰阳性菌 （G+）和革兰阴性菌 （G－）。 实验材料 * 菌种 表皮葡萄球菌 （Staphylococcus epidermidis） 大肠埃希菌 （Escherichia coli） 器材 载玻片、生理盐水、接种环、酒精灯、染色架 革兰染液 * 染色标本制备 实验步骤 染色标本制备 * 1. 涂片 在载玻片上标记菌名（s.e和e.c），然后用接种环各滴加1环生理盐水，将接种环在火焰上烧红，待冷却后挑取少量菌种与玻片上的水滴混匀后，在载玻片上涂布成一均匀的薄层，菌膜直径在0.5~1cm。 2. 干燥 涂好的菌膜在室温下自然干燥。 3. 固定 手持载玻片的一端，菌膜面向上，在火焰最热部分迅速通过3次，待玻片冷却后方可染色。 * 革兰染液 * 第一液（初染液）： 结晶紫染液 第二液（媒染液）： 卢戈碘液 第三液（脱色液）： 95%酒精 第四液（复染液）： 石炭酸复红液 革兰染色 * * 待染色片充分干燥后，用油镜观察。 制片的注意事项 * 1. 载玻片要洁净无油迹。 2. 滴生理盐水不要过多。 3. 挑菌量宜少。 4. 涂菌的动作要轻，防止菌液迸溅。 5. 涂片要均匀，菌膜宜薄。 6. 沾有细菌的接种环要及时火焰灭菌。 革兰染色的注意事项 * 1. 水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端流下，水流不宜过急，以免涂片薄膜脱落。 2. 选用培养18-24小时菌龄的细菌为宜，若细菌太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。 3. 酒精脱色是革兰染色的关键，要掌握好脱色的时间。 脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌； 脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。 实验结果 * 菌名 菌体颜色 菌体形态 G+或G－ 表皮葡萄球菌 大肠埃希菌 思考题 哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？ 你的结果是否正确？如果不正确，请说明原因。 注意 * 实验完成后，将染色片放入盛有石炭酸消毒液的玻璃缸内，切记乱放。 一般实验室常用普通光学显微镜对微生物的形态学进行观察。但是，微生物（尤其是细菌）细胞小而且透明，当把细菌悬浮在水滴内，用光学显微镜观察时，由于菌体和背景没有显著地明暗差，因而难以看清它们的形态，不易识别它们的结构。所以使用普通光学显微镜观察细菌时，往往要先将细菌进行染色，借助颜色的反衬作用，可以更清楚地观察到细菌的形状以及某些细胞结构。因此，为了研究微生物的形态特征和鉴别不同类群的微生物，微生物的染色及形态结构的观察是微生物学实验中十分重要的基本技术。 革兰染色法是最常用的细菌染色法之一。 * 革兰氏阳性菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构、壁厚。 革兰氏阴性菌，由于细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高。 * * 1. 涂片 在载玻片上标记菌名， [表皮葡萄球菌可标记（S.E.），大肠杆菌（E.C）] 然后在中央加1环生理盐水， [滴生理盐水不要过多,否则等待干燥的时间过长。] 将接种环在火焰上烧红， 待冷却后从斜面挑取少量菌种与玻片上的水滴混匀后， [一定要等接种环冷却，可在没有菌落的琼脂上沾一下，如果琼脂没有被烫化，就可以取菌了。取菌时注意不要不要取太多，沾到菌落即可，否则影响观察。] 在载玻片上涂布成一均匀的薄层，菌膜直径在0.5~1cm。 [可以再水滴的边缘沾一下，再将细菌与液滴均匀混合。] 2. 干燥 涂好的菌膜在室温下自然干燥。 [或者可将玻片在火焰上部微热烘干，但是不能在火焰上直接烘烤，以免菌体变形。] 3. 固定 手持载玻片的一端，菌膜面向上，在火焰最热部分迅速通过3次，待玻片冷却后方可染色。 [使细菌的细胞质凝固，使菌体与玻片粘得更牢固，加热固定可杀死细菌，可改变菌体对染料的通透性] 固定的方法将制成的标本匀速通过火焰三次 * 用结晶紫初染后，所有的细菌都被染成初染剂的蓝紫色， 碘作为媒染剂，能与结晶紫结合成结晶紫-碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。 当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。 革兰氏阳性菌用乙醇脱色时细胞壁脱水，使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。 革兰氏阴性菌，所以当脱色处理时，