学术讲座(免疫组化)幻灯片.ppt

在进行免疫组化染色时，必须证实组织内显示的反应产物，确实是抗原与相应的特异性抗体反应所产生的。由于免疫组织化学染色中影响抗原、抗体和免疫反应的因素很多，因此对免疫组织化学染色结果的评价必须设置对照组才能做出正确的判断。 常用的对照组有以下几种： 一、阳性对照 用已证实含用待测抗原的组织，与待检标本做同样处理后，进行免疫组化染色，结果应为阳性，称为阳性对照。每次实验都应做阳性对照，通过阳性对照可证明靶抗原有一定活性，染色过程中各个步骤以及所用的试剂都合乎标准，染色方法可靠。特别是当待检的标本为阴性结果时，阳性对照呈阳性反应，可排除待检标本假阳性的可能。所以若预期染色结果是阴性时，就必须设阳性对照。 二、阴性对照 用确知不存在待检抗原的组织切片染色，结果为阴性。阴性对证实组织内若不含靶抗原，就不应染色，可排除在染色过程中由于非特异性染色或交叉反应等因素造成的“假阳性”结果。 三、空白对照 是最常用的对照，用不加一抗的缓冲液，如PBS替代一抗，染色结果应为阴性，说明染色方法可靠，可排除组织的内源性过氧化物酶、碱性磷酸酶、自发荧光等物质引起的非特异性显色。 四、替代对照 用与第一抗体来源的同一动物免疫前血清，如第一抗体用的是兔抗人GFAP的IgG抗体，对照中用非免疫性的正常IgG血清来替代一抗，以相同的稀释倍数进行对照染色。这可证明待检切片中阳性结果不是抗体以外混杂的血清成分所致，而是所用特异性抗体与组织细胞内待检抗原的特异性反应的结果。但使用的商品抗体往往不能用同一种动物的免疫前血清做替代对照，也可用未经免疫的同种动物血清，即非免疫血清替代一抗。 五、吸收试验对照 用过量已知相应的纯化抗原与第一抗体反应，抗体结合点全部被抗原结合，这种被抗原吸收的抗体不能再与组织内的抗原反应，故再做免疫组化染色时，结果应为阴性。 六、自身对照 用同一组织切片上与待检抗原无关的其它结构做对照。阴性反应与阴性结构同在一个视野中，相互印证，这本身就是对阳性反应的特异性对照。但进行科研工作中，单纯用这种对照是不科学的。必须增加如空白对照、替代对照等，才能使染色结果得到承认。现代国际上发表文章，一般在免疫组化染色的同时，还须有Western blotting做相应蛋白质检测的实验结果加以证实。 * 碱性磷酸酶Alkalinephos phatase AKP ?? 分子100kDa，穿透细胞组织的能力较弱。某些组织细胞内含有较高的内源性碱性磷酸酶， 对IHC染色会产生一定的干扰 。 AKP主要用于血涂片或骨髓涂片的白细胞相关检测。 AKP的呈色反应的敏感性要比HRP高2—3倍，显色时间可从30min到48h，可与HRP组合进行IHC的双重或多重标记。另外，内源性碱性磷酸酶可以在底物缓冲液中加入左旋咪唑(1evamisole)和镁离子(氯化镁)，或提高底物缓冲液的pH值，可以有效地消除内源性碱性磷酸酶。目前该酶已广泛应用于原位杂交检测的显色和双重酶标染色。 ? * 免疫组化技术及 操做关键介绍 * 染色原理 免疫组化染色 Ag Ab 报告 提高敏感性 减少非特异性 * 染色原理 免疫组化染色 一抗 二抗 + 示踪剂 显色 直接法 间接法 ABC法 LSAB SP Envision法 * * 卵白素（avidin） ：鸡蛋白中的一种碱性蛋白，分子量为 68 kD，属于糖蛋白。 生物素（biotin），机体中的一种物质，又叫维生素H。 Avidin 和biotin 之间有很强的天然的亲和性。一个avdin分子有4个biotin的结合位点。 Biotin还可以和抗体IgG的Fc段结合，不影响IgG的活性。同时，生物素经活化后也可和过氧化物酶或ALP等结合，而不影响酶的活性。 * (avidin-biotin-peroxidasecomplex，ABC) 可接150个Biotin 临时混合 * 链霉亲和素（strept avidin），从链霉菌培养物中提取，比 avidin更好。 等电点接近于6.5，近中性，与被检查组织的非特异结合很少。 与Biotin形成复合物，穿透组织能力强。 用strept avidin 替代 avidin 的技术 SABC 法 SP法（Streptavidin-Peroxidase） 受内源性生物素和过氧化酶影响 * Envision法 （标记的葡聚糖聚合物法） 最敏感的方法，不受内源性生物素影响 葡聚糖聚合物 EnVision系统是将二抗和酶联接成一个多聚体（即EnVision）