药敏试验幻灯片.pptVIP

意义： ① 可预测抗菌药物治疗的效果， “敏感”治疗可能有 效；“耐药” 可能失败； ② 指导临床医生合理选择抗生素，AST的结果为“耐 药”，则应更换药物； ③ 提供所选择药物的依据； ④ 监测耐药性，分析耐药菌变迁，掌握耐药菌感染 病流行病学，控制和预防耐药菌感染发生和流行 一、纸片扩散法 （一）试验原理 将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种 测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药 物吸收琼脂中水分，溶解后不断向纸片周 围扩散形成递减的梯度浓度。在纸片周围 抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制， 从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。 抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的 敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负 相关关系，即抑菌圈愈大，MIC值愈小。 (二)培养基和抗菌药物纸片 1．抗菌药物纸片 选择直径为6.35mm， 吸水量为20μl的专用药敏纸片，用逐 片加样或浸泡方法使每片含药量达规 定要求。含药纸片密封贮存于2℃-8℃， 且不超过1周。 2．培养基 水解酪蛋白（M-H）培养基是 兼性厌氧菌和需氧菌药敏试验标准培 养基，4℃保存。 1.用接种环分别在琼脂平板上挑取形态相似 的大肠杆菌菌落4～5个，接种于3～5mL肉汤管中 2.35℃温箱培养2～8h，与标准比浊管比较，若菌液浓度太浓时，可用肉汤或生理盐水稀释至与0.5麦氏标准比浊管浊度相同 3.在15min内，用无菌棉签蘸取菌液，并在管壁上挤去多余的菌液后涂布于M-H琼脂平板上（注意：涂布要均匀、致密），待干 4. 用镊子蘸取95%乙醇并通过火焰，待烧干后再蘸取乙醇重复上述操作，共三次即可达到灭菌的效果。待冷却后，用此无菌镊子夹取不同药敏纸片，按一定间隔贴在平板的不同区域，即两纸片间距不小于24 mm，纸片距平板边缘不小于15mm。 5. 35℃温箱培养18～24h观察结果。 （四）结果判断和报告 用精确度为1mm的游标卡尺量取抑菌圈直径。根据NCCLS标准，作出“敏感”、“耐药”和“中介”的判断。 （五）药物敏感试验结果解释 “敏感”（susceptible，S）：表示测试菌可被测定药物常规剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制； “耐药”（resistant，R）：表示测试菌不能被在体内感染部位可能达到的抗菌药物浓度所抑制，临床治疗无效。 “中介”（intermediate，I）：表示测试菌对常规用药体液或组织中的药物浓度的反应率低于敏感株，使用高于正常给药量有疗效。 （六）质量控制 采用质控标准菌株和测试菌在同一条件下做 药敏试验 目的： 检查试验条件（如培养基、含药纸片和接种菌量）和操作技术等是否合格 质控标准菌株： 大肠杆菌ATCC 25922、粪肠球菌ATCC 29212、金黄色葡萄球菌ATCC 25923等 二、稀释法：琼脂稀释法 将药物混匀于琼脂培养基中，配制含不同浓度药物平板，使用多头接种器接种细菌，经孵育后观察细菌生长情况，以抑制细菌生长的琼脂平板所含药物浓度测得MIC。 MIC：稀释法所测得的某抗菌药物能抑制被检菌肉眼可见生长的最低浓度 琼脂稀释法具体实验步骤： 1. 抗菌药物储备液的配制：将各种抗菌药物制备成琼脂稀释法试验需要的药物浓度。 2. 含药琼脂培养皿的制备：将灭菌熔化的M-H琼脂在水浴中平衡至48～50℃，培养皿置超净台上。将稀释好的中间浓度的抗菌药物溶液2mL与18mL M-H琼脂混匀，立即倒入培养皿中，培养基厚度约4mm。待培养基冷却并使琼脂表面的水份蒸发干后备用。 3. 接种：将试验菌株在普通琼脂上划线培养，挑取4～5个形态特征一致的菌落接种于无菌M-H肉汤中培养8h，用生理盐水调节菌液浓度使其为0.5麦氏标准管浊度（1×108CFU/mL)，然后再用生理盐水稀释10倍，在15min内用定量接种器吸取1～2μL接种于制备好的M-H琼脂表面。并做好标记，标明接种点的位置。首先接种无药对照平皿，随后从最低药物浓度开始依次接种不同浓度的药物平皿。接种后的平皿在室温下静置，待接种点水份被琼脂吸收再将平皿反转，于37℃培养18～24h。 4. 结果判读：首先检查不含抗菌药物的对照组平板，必须每一菌株都有生长。平板放在黑色不反光的表面上观察，记录能完全抑制细菌生长的抗菌药物的最低抑菌浓度（磺胺可见少许散在细菌生长）。生长稀少或仅有一两个菌落的可忽略不计。如果低浓度药物平皿无菌，高浓度药物平皿却有细菌生长，应重复试验，检查待测细菌的纯度。 5.质量控制：每个琼脂平板应同时接种标准菌株（如大肠杆菌ATCC 25922）作为质控菌。 （一）常量稀释法实验步骤： 1. 取无菌小试管10支排于试管架，于第一管加入MH肉汤1.9ml，2～10管各加1ml。 2. 于