酶的生物改造幻灯片.pptVIP

Compound Library Unique Compound in Each Well Assay Target Plate Reader Same Assay and Target in Each Well Mother Plate Daughter Plate Assay Plate 采用高通量筛选的技术对构建的突变菌库进行筛选 筛选 得到酶热稳定性提高的12株菌株 天冬氨酸转氨酶热稳定性的进化 未突变前酶的热稳定性 * 热稳定性定义为55℃下放置10min后酶活性与放置前酶活性的比值 * Figure 2. The Molecular Breeding directed molecular evolution process. * 3、基因突变库的筛选方法 目标 根据定向进化要求，在一定的环境要求下进行筛选，从突变基因文库中得到所需的突变基因。 难点 突变库容量大，一般达到106，工作量巨大 关键 高通量筛选：通量大，效率高 方法 平板筛选法，荧光筛选法，噬菌体表面展示法，细胞表面展示法 平板筛选方法 依据细胞生长情况筛选 热稳定性：温度梯度和高温环境 抗生素耐受性：抗生素浓度梯度 pH稳定性： pH梯度 极端环境：高盐、低温、高浓毒物质 平板筛选方法 依据颜色变化筛选 大肠杆菌?-半乳糖苷酶基因显色：噬菌体DNA载体（蓝色） 反应产物显色：磷酸酯酶水解硝基酚磷酸生成黄色硝基酚 脂肪酶筛选 海因酶筛选 平板筛选方法 依据透明圈大小筛选 淀粉酶的进化：淀粉平板培养基 豆鼓纤溶酶的进化：血纤维蛋白培养基 荧光筛选方法 利用自身荧光激发特性 生成产物本身是具有荧光激发特性的物质 利用荧光报告基因 辣根过氧化合物酶和单加氧酶的融合基因： 原理：萘→萘酚→醌类化合物（能激发荧光） 绿色荧光蛋白基因：获2008年诺贝尔化学奖 2008年诺贝尔化学奖介绍 获奖 2008年度诺贝尔化学奖授予日本科学家下村修、美国科学家马丁·沙尔菲，以及美国华裔科学家钱永健。他们三人因为在绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）研究和应用方面做出的突出贡献将各分得2008年度1／3的诺贝尔化学奖奖金。 2008年诺贝尔化学奖介绍 评论 生物学有些现象只能在打碎细胞以后才能做，所以实际上是从“死物”上来推测生物的情况。而下村修、钱永健和马丁·沙尔菲发明的用荧光分子标记其他分子的方法，使科学家们能在活细胞、活生物上直接观察一些生物现象。所以，可以说是把一些“死物学”变成了真正的“生物学 （北大饶毅） 绿荧光水母—通过体内绿色荧光蛋白发光 科学家在线形虫体内植入 绿色荧光蛋白质 绿色荧光蛋白的应用 分子标记：GFP标记的微管结构 绿色荧光蛋白的应用 分子标记： FISH分析菌株 （a）未加探针；（b）DAPI染色（c）α-探针杂交（d）Msint-1268探针杂交菌株Y1；（e）Msint-1268探针杂交M. trichosporium OB3b 绿色荧光蛋白的应用 药物筛选 绿色荧光蛋白的应用 融合表达：线粒体中表达的GFP 绿色荧光蛋白的应用 生物传感器： GFP在植物研究中的应用 噬菌体表面展示法 内涵 利用丝状噬菌体的外膜结构蛋白与某些特定的外源蛋白或多肽分子形成稳定的复合物，使外源蛋白或多肽富集在噬菌体表面的一种分子展示技术 特点 有效性高，是前景广阔的筛选方法 噬菌体显示筛选模式 噬菌体显示的几种类型 M13噬菌体pIII和pVIII的显示 酵母细胞表面展示法 通过锚定在酵母细胞表面的特点蛋白质与某些外源蛋白质或多肽形成稳定的化合物，使外源蛋白或多肽富集在酵母细胞表面的一种分子展示技术。 核糖体显示技术 RNA-蛋白质融合技术 RNA-蛋白质的融合 寡霉素与核苷酸的连接 Myc ds-DNA的富集 实例：天冬氨酸转氨酶的热稳定性的定向进化 　高通量筛选方法的建立 　生物信息学技术手段的建立 　天冬氨酸转氨酶热稳定性的改造 研究内容及执行情况 高通量筛选方法的建立 基于酶联免疫分析方法，选用医用检测试剂盒作为检测试剂，建立了快速高效的酶活性检测方法，结合使用96孔酶标板，形成了酶的高通量筛选方法。 建立了改进的可高通量操作的质粒快速检测方法，改进后的质粒快检工作量为原方法的1/3左右，可用于高通量筛选和鉴定所构建的基因工程菌。 生物催化的数据整合和信息分析 峰值运算速度达3000亿次/秒的集群系统 基因表达 蛋白质表达 蛋白质-DNA相互作用 蛋白质-蛋白质相互作用 基因和其他功能相互作用 蛋白质定位 网络调节 功能注解 …