紫外分光光度法讲义.ppt

* 紫外分光光度法 检测山楂总黄酮方法的建立 作者：张 雪 , 丁长河 期刊：食品工业科技2007年第7期 汇报人：宋慧军 摘要 有关总黄酮的测定方法有: 戴维斯法、薄层层析- 比色法、微分脉冲极谱法、硝酸铝显色法、紫外分光光度法等。 缺陷： 鲜山楂果胶含量达 3.0%以上, 但上述方法均忽略了山楂果胶对总黄酮含量的影响。 本实验内容及目的 ：本实验针对上述检测方法存在的问题, 根据现有条件对硝酸铝显色- 分光光度法进行改进, 以芦丁为标准品,利用果胶酶将山楂果肉中的果胶分解后, 再进行黄酮的含量分析, 减少果胶对检测黄酮的影响, 建立起更加精确的紫外分光光度法山楂总黄酮分析系统, 旨在为山楂总黄酮的定量及生物功能评价提供检测方法 1 材料与方法 1.1 材料与仪器芦丁对照品 ( Quercetin 3β - D- rutinoside) 中国药品生物制品检定所; 山楂鲜果 北京市密云县产,色泽鲜红, 无病虫害; 果胶酶 活力: 20000u/g, 天津市利华酶制剂厂; 1N NaOH 溶液, 5%NaNO2 溶液, 10%Al(NO3)3 溶液。 YP1200 电子天平, 手持糖度计, 电热恒温水浴锅 , 722S 分 光 光 度 计 , TGL- 16C 离 心 机 , PHS- 25 酸度 计 , 裹 包 式 榨 汁 机 , 自 动 电 位 滴 定 计 , Biorad SmartspecTM3000 Spectrophotometer 紫外分光光度计( 美国伯乐公司) , FA1004 万分之一分析天平 ( 上海精密仪器厂) , GL- 20B 冷冻离心机( 上海安亭科学仪 器厂) 。 1.2 实验方法 1.2.1 实验原理 ： 黄酮化合物的母核(图 A)由 C6- C3- C6 即 A- C- B 三个环组成, A 环和 B 环具有芳香化合物的性质, C 环具有黄酮化合物的独特性质。 母核中某些位置如 C3 和 C5 上含有羟基时能与铝、铅等金属离子形成稳定的络合物, 这些络合物在光谱上产生明显变化。 黄酮与金属离子的这种作用不仅可以用于鉴别这类成分中羟基的位置, 还可以作为进行定量分析的基础。 本实验就是采用这种原理, 通过 Al3+与黄酮形成鲜黄色的络合物( 图 B, 图 C) 在最大吸收波长处有一吸收峰然后比色测定而进行定量的。 1.2.2 标准溶液配制 精密称取芦丁对照品 10.03mg,加 60%甲醇适量, 置水浴中加热溶解, 放冷, 以60%甲醇定容于 100mL 容量瓶中, 摇匀备用, 配成芦丁含量为 0.103mg/mL 的工作液, 备用。 1.2.3 标准曲线建立 1.2.3.1 最佳检测波长选择 取芦丁标准溶液于 400～600nm 范围内进行扫描, 确定黄酮的最大吸收波长。结果为510nm（文献当中没有给图） 1.2.3.2 标准曲线建立 精确吸取浓度为 0.103mg/mL的 芦 丁 标 液 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL, 置 于25mL 容量瓶中, 准确加入 5% NaNO2 溶液 1mL 摇匀, 放置 5min, 再准确加入 10% Al( NO3) 3 溶液 1mL摇匀, 放置 6min, 然后加入 4mL 1N NaOH 溶液, 最后用 30%乙醇稀释到刻度, 于温水浴中加热 10min 取出, 用 1cm 玻璃比色皿在 510nm 处测定吸光度 A,同时以未加标准芦丁的溶液作空白参比。 以吸光度对标样含量毫克数作图。 经线性回归表明, 芦丁在 0~0.618mg 范围内呈良好的线性关系, 达到显著水平。 典型的标准曲线如图 所示。 回归方程为 Y=1.2389X+0.0039(r=0.9998,α =0.01)。 1.2.4 样品测定 1.2.4.1 样 品 液 制 备 方 法 称 取 山 楂 鲜 果 约 50g 八份, 拣选、清洗后加蒸馏水 125mL, 浸泡 0.5h 后加热软化至 90℃, 用组织捣碎机打碎成匀浆, 冷却恒温至45℃后, 其中四份直接榨汁, 然后离心、过滤后定容至150mL 备用; 取另外四份加 0.07%的果胶酶, 45℃恒温酶解 4h, 将已经过酶解处理的样品 90℃、15min 加热灭酶, 然