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第十二章 现代生物技术在发 酵工业中的应用 第一节 概 述 第二节 工程菌的发酵 第三节 动植物细胞的组织培养 第四节 固定化细胞发酵 第一节 概 述 生物技术(biotechnology)，又称生物工程或生物工艺学等。它是近代发展非常迅速的一门综合性科学技术，涉及许多科学领域。 生物技术是应用生物科学的理论、方法和技术，按照人们设计的蓝图，改良和加工生物或用生物及其制备物作为加工原料，提供所需的生物制品，为人类服务的综合性科学技术。 1、工程菌的来源 基因工程菌：在生物体外对DNA分子进行重新组合，然后克隆到适合的宿主细胞，进行增殖和表达，所得到的重组菌株即是工程菌。 2、生产用工程菌应具备条件 ① 产品高浓度、高转化率和高产率；分泌型菌株最好； ② 能利用常用的碳源(如糖蜜、淀粉等)，并可进行连续培养； ③ 菌株不致病，也不产生内毒素； ④ 发酵所产生的热量和需氧量都低，发酵温度适当； ⑤ 代谢控制容易进行； ⑥ 重组DNA稳定，不易脱落。 3、工程菌的应用 蛋白类药物产品：如胰岛素、干扰素、生长激素等，还有几十种正在开发中。 氨基酸生产：如高产的苏氨酸工程菌。 维生素生产：能直接转化葡萄糖为2-酮基-L-古龙酸的工程菌，为维生素C生产开辟了新的途径。 抗生素生产：如将头孢菌素生物合成的限制性扩环酶基因克隆到产生菌中，使头孢菌素C的产量提高了15％。 (一)基因重组细胞的种类 原核：大肠杆菌和枯草杆菌 真核：酵母菌和哺乳动物细胞等。 (二)工程菌的培养 1．培养装置 重组大肠杆菌——通气搅拌罐 实验室中以基础实验设备进行（一般采用通气搅拌发酵罐，如：大肠杆菌）；但操作要谨慎，防止工程菌株的外漏和扩散； 中试试验必须要有良好的重复性，应用全自动的控制系统，减少接触，并且尽可能地获得大量的发酵参数。 工程菌的培养装置既要防止外界微生物侵入罐内，污染杂菌，又必须不使重组体外漏。这是与沿用的通气搅拌式培养罐的区别所在。 重组动物细胞——动物细胞培养装置(安瓿瓶) 2．培养基和高密度发酵 工程菌发酵有两条基本要求：使菌体生长良好，获得高浓度菌体(即高密度发酵)，才能得到最多的产物。 一般的微生物发酵菌体干重：大肠杆菌125g/L；酿酒酵母145g/L。基因工程菌更高，一般达到200g/L。 其次，发酵用培养基尽可能的简单，以便分离产物。 使用合成培养基，包括葡萄糖、铵盐和无机盐等。 使用尽可能廉价的维生素或氨基酸的营养缺陷型的工程菌。 3．菌株和质粒的稳定性 工程菌中的质粒的稳定性（传代）和质粒内在的稳定性很重要。质粒保存率高，相应地就会得到高浓度的产物。 可利用质粒带氨苄青霉素等抗生素抗性标记。目前多采用两个以上的抗生素抗性标记的质粒，带有这种质粒的菌株在药物的存在下能够生长，反之则菌株则不能够生长。利用这种选择性，还可以对工程菌遗传稳定性进行检测。 三、安全问题 （一）重组DNA实验准则 准则主内容：物理密封（P1～P4）和生物学密封（B1和B2） 物理密封：将重组菌封闭于设备内，以防止传染给实验人员和向外界扩散。（实验设备、实验室设计、试验注意事项） 生物学密封：用只有在特殊培养条件下才能生存的宿主（如维生素或氨基酸营养缺陷型），同时用不能转移至其它活细胞的载体，通过这样组合的宿主载体系统，可以防止重组菌向外扩散。 (二)防止基因重组菌外漏的措施 培养工程菌的外界条件至少要遵守物理密封(P1～P4)方法中的P1级规定。从生物安全性来考虑，常采用维生素或氨基酸营养缺陷型的工程菌。 生产中，以下部分和操作均应采取一些措施，以防重组菌外漏：①排气；②机械密封；③取样；④培养后的灭菌；⑤接种；⑥放罐。 企业中进行重组菌培养的设备标准有LS-1和LS-2。 1. 概念 2.动物细胞培养生产的药物类型 目前利用动物细胞生产的药物有5大类： 1）病毒疫苗。如脊髓灰质炎、狂犬病、乙型肝炎等疫苗。 2）免疫调节剂。如干扰素、白细胞介素、胸腺素、转移抑制因子等。 3）激素。如绒毛促性腺素、生长激素、促红细胞生成素等。 4）人体活性蛋白。如胰岛素、血纤维蛋白溶酶原。 5）药用酶。尿激酶、天门冬酰胺酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等。 细胞来源：胚胎及成幼龄动物的组织器官 目前可大规模培养的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、cho（中华仓鼠卵巢）细胞、BHK-21(仓鼠肾细胞)、Vero细胞(非洲绿猴肾传代细胞，是贴壁依赖的成纤维细胞)等，并已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、单克隆抗体等产品。 2.培养条件 温度为37 ℃±0.5℃ pH接近中性6.8-7.