第五章 酶与细胞的固定化课件.ppt

第五章 酶与细胞的固定化 一、酶与细胞的固定化 二、固定化酶和固定化细胞的性质与表征 三、固定化酶和固定化细胞的应用 第五章 酶与细胞的固定化 一、酶与细胞的固定化 酶作为工业催化剂存在的缺陷： 1）稳定性差 2）分离纯化困难 3）回收困难 （一）固定化酶和固定化细胞的定义 1、固定化酶 固定化酶(immobilized enzyme)概念：P220 优缺点：P220 2、固定化细胞 概念：P221 优缺点：P221 柱式酶反应器工作原理示意图 （二）酶和细胞固定化方法 1、酶的固定化 （1）一般方法及特点 关键在于选择适当的固定化方法和必要的载体以及稳定性研究、改进。 1）三大类方法（或四大类方法）： 载体结合法 吸附法（包括电吸附法）、结合法（无机多孔材料） 交联法（双功能试剂） 包埋法（微胶囊法） 2）选择方法依据： a、酶的性质。 b、载体的性质。 c、制备方法的选择。 3）固定化后酶的考察项目： a、测定固定化酶的活力，以确定固定化过程的活力回收率。 b、考察固定化酶稳定性。 c、考察固定化酶最适反应条件。 （2）酶的固定化方法 1）载体结合法 概念：P222 a、物理吸附法 利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在载体表面上。选择载体的原则:（a）要有巨大的比表面积;（b） 要有活泼的表面;（c） 便于装柱进行连续反应。常见载体有无机载体（高岭土、硅胶、氧化铝、多孔玻璃、活性碳、羟基磷灰石等），有机载体（纤维素、胶原、大孔合成树脂、陶瓷、海藻酸钠CA等）。相对于有机载体，无机载体材料大多成本低、使用寿命长、机械强度高和耐酸碱等特性而更具实用性。 b、离子结合法 也称离子交换吸附法。常见载体有阴离子交换剂（DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等），阳离子交换剂（CM-纤维素等）。使用中必须注意：pH、离子强度、温度。 c、共价结合法 可以形成共价键的基团：游离氨基、游离羧基、巯基、咪唑基、 酚基、羟基、甲硫基、吲哚基和二硫键等。常见载体有天然高分子衍生物（纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖等），人工合成的高聚物（聚丙烯酰胺PAM、聚苯乙烯、聚乙烯醇PVA、尼龙等），无机载体（多孔玻璃等）。 c、共价结合法 载体活化的方法有重氮法、叠氮法、烷基化反应法、硅烷化法、溴化氰法等。 重氮法 目前在我们国内用的较多的载体是对氨基苯磺酰乙基（ABSE）纤维素、琼脂糖，葡聚糖凝胶和琼脂等。该方法需要载体具有芳香族氨基。 叠氮法 对含有羧基的载体，与肼基作用生成含有酰肼基团的载体，再与亚硝酸活化，生成叠氮化合物。最后与酶偶联。包括酯化、 肼解、 叠氮化、偶联等步骤。 烷基化反应法 含羟基的载体可用三氯三嗪等多卤代物进行活化，形成含有卤素基团的活化载体。 溴化氰法 本方法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖类物质。如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等，其中以琼脂糖为载体的占多数（大孔网状结构）。用溴化氰法活化琼脂糖制备得到的固定化酶目前使用很广，特别用作亲和层析，有着良好的性能。 2）交联法 借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。常见的功能团：N末端氨基、Lys氨基、Tyr酚基、Cys巯基、His咪唑基等。常用试剂：戊二醛、异氰酸酯、N，N’乙烯马来亚胺、双重氮联苯胺等。应用最广泛的是戊二醛，它两个醛基都可以与酶或蛋白质的游离氨基形成席夫碱(shiff)。 交联法有2种形式即酶直接交联法和酶辅助蛋白交联法。 酶直接交联法：在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间的平衡。 酶辅助蛋白交联法：为避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰而引起酶失活，可使用第二个载体蛋白质（即辅助蛋白质，如白蛋白、明胶、血红蛋白等）来增加蛋白质浓度，使酶与惰性蛋白质共交联。 分子内交联：多数发生于低的酶浓度，交联后酶通常仍保持溶解状态。 分子间交联：发生于较高酶浓度下，交联后酶通常保持不溶解状态。 3）包埋法 将聚合物的单体和酶溶液混合后，借助聚合促进剂（如交联剂）的作用使单体进行聚合，从而将酶包埋于聚合物中的固定化方法。 网格型包埋法：将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称为凝胶包埋法。聚丙烯酰胺凝胶（PAM）、聚乙烯醇（PVA）以及天然高分子化合物等。 微囊型包埋法：是将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。 举例海藻酸钙包埋法