蛋白质组学的基本研究方法课件.ppt

蛋白质组学的基本研究方法 Outline一、概述二、蛋白质的提取与样品制备三、蛋白质的分离与二维电泳技术四、蛋白质的检测技术五、生物质谱技术与蛋白质的鉴定六、蛋白质构象解析技术 一、概述1、蛋白质组学研究远比基因组研究复杂（1）一个生物对象的蛋白质数量远大于基因数量（2）基因组的组成是固定的，蛋白质组组成是动态的（3）细胞内蛋白质的拷贝数（108）远比基因拷贝数大（105）（4）基因可采用PCR扩增和自动测序，而蛋白质还没有扩增和自动测序技术 2、蛋白质组学研究技术进展 （1）1975年，2-DE技术建立 （2）上世纪80年代，固相化pH梯度凝胶问世，使2D-E的重复性和加样量改善 （3）上世纪末期，MALDI-TOF-MS和ESI-MS可精确测定相对分子量和微量 （4）快速多肽序列 （5）90年代，多图象分析与大规模数据处理软件问世，复杂蛋白质图谱处理成为现实  二、蛋白质的提取与样品制备 （1）PMSF：苯甲磺酰氟，工作浓度1M，能不可逆灭活丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶，但在水溶液中失活。（2）AEBSF：可在水溶液中使用，工作浓度4M，能不可逆灭活丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶，但可能改变蛋白质的等电点。（3）EDTA、EGTA：乙二氨四乙酸和乙二醇双四乙酸的工作浓度为1M，作用对象为金属蛋白酶。（4）肽蛋白酶抑制剂：价格贵，本身会出现二维电泳图中。 亮抑酶肽：在DDT中可逆抑制丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶。 胃蛋白酶抑制剂A：作用对象为天冬氨酸蛋白酶。 抑蛋白酶A肽：作用对象为丝氨酸蛋白酶。 苯丁抑制素：作用对象为氨基蛋白酶。（5）TLCK、TPCK：甲苯磺酰赖氨酰氯甲酮、甲苯磺酰苯氨酰氯甲酮的工作浓度为0.1-0.15mM,能不可逆灭活丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶。 4、蛋白质沉淀步骤（1）硫酸铵盐析 原理：高盐将蛋白质沉淀出来，从而与核酸分离 步骤：蛋白质浓度1mg/ml，缓冲溶液浓度50mM(含EDTA),缓慢加  入(NH4)2SO4,搅拌10-30min，离心分离。 注意点：只用作预分离和富集，且(NH4)2SO4 会干扰IEF（2）TCA沉淀 三氯乙酸（终浓度10-20%）加到提取液中混均，置冰上30min，最后用丙酮或乙醇清洗沉淀除TCA。该法不易造成蛋白质变性和化学修饰。（3）丙酮沉淀 提取物加入3倍体积的冰丙酮，-200C沉淀2小时，离心空气干燥去丙酮。（4）丙酮/TCA沉淀 用丙酮在10%的TCA中重悬样品溶液（含有0.01的?-巯基乙醇或20mmol/L),-200C沉淀45min,离心分离,丙酮清洗沉淀,空气干燥。（5）苯酚提取 蛋白质提取到饱和酚中，加到甲醇溶液中NH4CA沉淀，然后先用NH4CA洗涤，再用丙酮洗涤，空气干燥去丙酮。本法适合于高杂质的植物样品。 5、清除影响二维电泳图谱的杂质（1）盐、残留的缓冲液和电性小分子 盐等带电物质会干扰电泳过程、增大溶液电导率，通常用透析、凝胶过滤、沉淀/重悬的方法脱盐，但易使样品丢失。 （2）内源性小分子 这些物质通常带负电，使阳极侧的聚焦不全，可采用丙酮/TCA沉淀去除。（3）离子去污剂 SDS等离子去污剂，易和多肽形成复合物而干扰IEF，-200C的丙酮溶液可除去。 （4）核酸 核酸增加样品黏度，导致二维电泳背景发散；能与蛋白质结合，阻碍聚焦；银染时出现高背景。加0.1V的核酸酶溶液(1mg/ml DNAase+0.25 1mg/ml RNAase+50mmolMCl2)冰上孵育,但要注意核酸酶本身会出现在图谱中。（5）多糖 多糖能阻碍凝胶孔径、与蛋白质形成复合物，可用(NH4)2SO4或苯酚- NH4CA沉淀后离心，或用超速离心去多糖  （6）脂类 脂类易和膜蛋白结合成复合物，改变蛋白溶解性、等电点和分子量，采用大量去污剂可除去。 （7）酚类 通常出现在植物组织中，通过氧化反应修饰蛋白质，可用沉淀法去除，或加抑制剂灭活多酚氧化酶。6、裂解液的组成 目的：加入裂解液主要是确保一向等电聚焦之前样品的完全溶解和变形 组成：尿素+去污剂+（有时）还原剂  原理：（1）尿素能溶解和解折叠蛋白，最低作用浓度为8M，硫脲可增加膜蛋白的溶解（2）去污剂防止疏水相互作用蛋白质聚合，常用的去污剂有NP-40、TritonX100，同时加4%CHAPS或0.25%SOS效果更好。（3）还原剂用于断裂二硫键，常用的有DTT（二硫苏糖