实验 细胞器的分离.pptVIP

密度梯度离心法：使离心溶液含有密度逐步增加的（密度梯度）极易溶解的惰性物质，例如蔗糖，利用这一密度梯度来维持重力的稳定性和抑制对流。操作时，将细胞匀浆液置于离心管的最上层，随后离心，这样，不同大小、形状、密度的细胞结构，由于它们的沉降系数不同，就会以不同的速率向下移动，分别集中到相应的密度区带而得以分离。 实验注意事项： 1.冰水中匀浆肝组织； 2.过滤匀浆液的纱布事先用预冷蔗糖液浸湿； 3.收集液体要避免吸到脂肪层； 4.标记玻片。 * 一、实验仪器 每组（两人） 匀浆器一个，大小烧杯各一个，5ml和15ml离心管各两支，小漏斗一个，纱布一块（用完后要清洗备用），低速离心机（郑冰蓉老师处借来）和高速离心机11000rpm。 二、实验药品 生理盐水或（蛙的为0.65%），蔗糖溶液（0.25Mol/L蔗糖和3Mol/LCacl2配制成蔗糖缓冲液），健那绿B，吉姆萨 细胞内各种结构的密度、形状、大小各不相同，因此它们在同一离心场内的沉降速率就不相同。而且在进行沉降时各自要求的离心力也不相同。差速离心的方法就是根据这一原理，利用不同的离心速度所产生的离心力，将各种亚细胞组分和颗粒分别分离开。当离心力低，离心时间短时，细胞核即可沉到管底；加大离心力后，又可分离出线粒体：离心力再加大，又能分离出微体和核糖体。 上图为移动区带离心，梯度存在的主要目的是减少样品的扩散，使待分离的物质处于不同的密度当中，待分离颗粒的密度比离心管中任何部分介质的密度都大。 等密度离心分离细胞器，这一密度的目的是为了阻止颗粒移动，当颗粒达到与本身密度相同的密度区时就会停留在该区域。 纱布过滤，还需要准备漏斗。 需要的冰。 实验结果中观察有脂肪油滴的存在。 细胞器的分离:细胞核与线粒体的分级分离 实验六 一、实验目的 了解用差速离心的方法分级分离细胞组分的原理和过程。 熟悉离心机、匀浆器的使用方法。 差速离心：根据被分离物质的体积差异，逐渐提高离心速度以分离大小不同的细胞器的方法。体积大的沉降快，反之，则慢。 可分离较大颗粒，如细胞核 可分离较小颗粒，如线粒体、高尔基体、溶酶体 上清液 二、实验原理 三、实验步骤: 蛙肝 ↓冷生理盐水10ml洗，吸干水分，放在小烧杯中 ↓加入预冷蔗糖液(少于9ml)，剪碎 匀浆 ↓纱布过滤至15ml离心管，溶液体积14ml。 滤液→做涂片① ↓2000 rpm离心10 min 沉淀 上清液 →做涂片② ↓加预冷蔗糖液至10ml，吹打均匀 ↓5ml,11000 rpm离心10 min，弃上清液 混合液 沉淀 ↓2000 rpm离心10 min，弃上清液 ↓加2ml预冷蔗糖液，吹打均匀 沉淀 混合液 ↓加1ml蔗糖液，混匀 ↓11000 rpm离心10 min 做涂片③ 沉淀 上清液 ↓ ↓ 取少许于载片, 取1滴于载片 加健那绿B 混匀④ 加健那绿B 混匀⑤ ①、②、③片，自然干燥后，放入Giemsa染液缸中染色5min，用蒸馏水洗去染液，镜检。 ④片先滴1—2滴健那绿B于玻片上，挑少许沉淀在染液中混匀，染5min，加盖片镜检。 ⑤片先滴1—2滴健那绿B于玻片上，滴一滴上清液在染液中混匀，染5min，加盖片镜检。 * 一、实验仪器 每组（两人） 匀浆器一个，大小烧杯各一个，5ml和15ml离心管各两支，小漏斗一个，纱布一块（用完后要清洗备用