体内药物第三章生物样品与样品制备教案.ppt

第三章 生物样品与样品制备 一、种类、采集和制备 (一) 血液(Whole blood, Plasma, Serum) 1、血样采集 2、血样制备 血浆的制备 血液→含有抗凝剂的试管→混合→ 2500r／min～3000r／min离心5min →上清液即为血浆。 血清的制备 血样→室温放置30min到1h →出现血饼→剥去血饼→以2000r/min～3000r/min离心5min～10min →分取上清液即为血清 (二) 尿液 1、尿药测定用途：药物剂量回收研究、药物尿清除率、生物利用度、判断患者用药是否遵医嘱、预测药物的代谢过程和代谢类型 2、尿的采集：非损伤性采样方式、药物浓度较高、收集量较大、收集方便，易受食物、饮水等影响。 3、尿样的保存与处理： (三)唾液 1、唾液的采集：漱口后15min进行，采集时间为10min，采用一些物理或化学方法刺激唾液分泌；（1）缩短采样时间，（2）减小唾液pH变化范围，（3）刺激后得到的唾液其唾液－血浆分布比例的个体差异较小。 2、唾液的保存与处理：取样后，除去泡沫，分层后离心，取上清液冻存或直接分析。 3、优点：（1）非损伤性取样，（2）可用于药代动力学研究，（3）不受采血时间和地点限制，（4）样品易收集，病人易接受 4、应用：（1）在TDM中的应用根据S/P分类，S/P＜1.0表示药物在唾液中的浓度很低；S/P＝1.0表示适合药物的监测；S/P不固定表示药物显著转移到了唾液中；S/P很大表示药物的离子化程度很低 （2）药代动力学参数的测定 二、生物样品的贮存与处理 （一）冷藏或冷冻 1、血浆和血清：采血后及时分离（2h），短期4℃，长期-20℃ 2、尿样：应立即测定，否则需加防腐剂置冰箱保存 3、唾液：在4℃下保存，往往需要在取样时测定pH值 4、生物样品总的原则：临时解冻，解冻的样品一次测完，不能反复冷冻→解冻→冷冻(FTC)；样品应以小体积分装存放。 第二节 生物样品的预处理与制备 一、预处理目的 （一）药物从缀合物中释放，测定总浓度 （二）纯化、富集药物 （三）适应和满足测定方法要求的灵敏度 （四）防止对分析仪器的污染和劣化 二、样品制备时应考虑的问题 （一）药物的理化性质、存在形式和浓度范围 （二）药物测定的目的 （三）生物样品种类和杂质干扰类型 （四）样品的化学组成 （五）药物的蛋白结合率 （六）被测组分在预处理过程中的稳定性 （七）样品在收集、储存等过程中容器的污染 （八）样品的预处理过程要求简便 （九）预处理的最后一步应富集被测组分 （十）对分析方法的要求 三、样品的预处理技术 （一）经有机破坏的方法 1、湿法破坏2、干法破坏 硝酸－高氯酸法高温电阻炉灰化法 电热消化器法低温等离子灰化法 电热板消化法 烘箱消化法 3、氧瓶燃烧法 （二） 去除蛋白质 1、溶剂解法 常用溶剂（与水相混溶的有机溶剂）： 乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、 丙酮、四氢呋喃 体积比：1：1～3 90％去除 方法：超速离心（10000r/min） （二） 去除蛋白质 2、加入中性盐 常用中性盐（置换蛋白结合的水，使蛋白脱水而沉淀）： 饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐、枸橼酸盐 比例：1：2 90％去除 方法：超速离心（10000r/min） （二） 去除蛋白质 3、加入强酸 常用溶剂（与蛋白质阳离子形成不溶性盐沉淀）：10％三氯醋酸、6％高氯酸、硫酸－钨酸混合液、5％偏磷酸 体积比：1：0.6 90％去除 方法：超速离心（10000r/min） 4、固相微萃取法（Solid-phase micro- extraction SPME）最先由加拿大Waterloo大学的Pawliszyn教授的研究小组于1990年首次进行开发研究,属于非溶剂型选择性萃取法。SPME已由美国的Supelco公司在1994年实现商品化 （1）装置 （2）方法萃取过程:将萃取器针头插入样品瓶内→使具有吸附涂层的萃取纤维进行萃取→拉起活塞→拔出针头Direct-SPME:是将纤维直接插入样品溶液中进行萃取, 达到分配平衡后即可取出进行色谱分析。Headspace-SPME:不是直接将纤维插入溶液中而是在液上进行顶空萃取, 不与样品接触，可避免基体干扰和提高分析速度。 解吸过程SPME–GC 解吸方式通常为热解吸，解吸温度一般为150℃～250℃，气相的载气流也有助于解吸。整个过程实现了无溶剂化，提高了柱效，减轻了环境污染。在SPME–HPLC中，通常要采用六通阀装置，使待测物在适当的溶剂中解吸（称之为溶剂解吸），并将待测物带入检测器。选择适当的洗脱剂和洗脱时间可避免峰展宽。原理： n＝萃取涂层中所吸附的待测物的量 Ks1＝待测物在涂层和样品基质间的分配系数 Vs＝萃取头固定相液膜的体积 V＝样品溶液的体积 C0＝待测物