基因组DNA提取与扩增.doc

酚：氯仿法基因组的提取 1.取小块肌肉组织于600μl TNES中剪碎，加蛋白酶K（20 mg/ml）3μl(至终浓度为100 μg/ml)，于56 ℃3 h，使组织块完全消化。 2.加600μl酚：氯仿：异戊醇=25：24：1，缓慢的来回颠倒离心管10 min，充分混合两相至乳浊状。 3.室温12000 rpm 10 min，取上清至新EP管。 4.向上清中加等体积的氯仿：异戊醇=24：1，颠倒摇动10 min。 5.室温12000 rpm 10 min，取上清至另一新EP管。 6.向上清中加0.1 V的NaAC（3 mol/L）pH 5.2，1 V的异丙醇，混匀后室温静置4-5 min。 7.12000 rpm 10 min，去上清（用枪吸）。 8.70%乙醇洗沉淀，12000 rpm 5 min，用枪吸出上清，轻旋后用小枪彻底吸出乙醇；凉干。 9.水溶后加1μl RNase，37℃孵育30 min。 1 mol/L Tris:20 ml DDW 16 ml Tris碱 2.422 g 浓HCl(约0.84 ml)调节pH至8.0，加DDW至20 ml，高压灭菌。 5 mol/L NaCl: 20 ml DDW 16 ml NaCl 5.844 g 加DDW定容至20 ml，分装后高压灭菌。 0.5 mol/L EDTA：20 ml DDW 16 ml 乙二胺四乙酸二钠 3.722 g 用固体NaOH调节pH至8.0（约0.4 g），定容至20 ml，高压灭菌。 10% SDS：20 ml DDW 16 ml SDS 2 g(加热至68℃助溶) 加入几滴浓盐酸调节pH至7.2，加DDW定容至20 ml. 10 M Urea:1ml Urea 12.012 g DDW 14ml 定容至20 ml。 TE缓冲液 pH 8.0：20 ml 10 mM Tris-Cl pH8.0 1 mM EDTA pH8.0 1 mol/L Tris-Cl 200 ul 0.5 mol/L EDTA 40 ul 加DDW 29.76 ml定容至20 ml。 10 mg/ml RNA酶：1 ml Rnase A 10 mg (10 mmol/L Tris-Cl(pH 7.5)、15mmol/L NaCl) 1 ml 于100℃加热15 min，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。 1 mol/L Tris-Cl 0.5 ml DDW 9.5 ml 定容至10 ml。 取1 ml加5 mol/L NaCl 3 ul。 TNES： 10 mM Tris-Cl pH8.0，125 mM NaCl，10 mM EDTA pH8.0，0.5% SDS，4M Urea。 配制TNES 30 ml 1 mol/L Tris-Cl 300 ul 5 mol/L NaCl 750 ul 0.5 mol/L EDTA 600 ul 10% SDS 1.5 ml 20 M Urea 12 ml 加DDW 14.85 ml定容至30 ml。 20 mg/ml蛋白酶K：1 ml 蛋白酶K 20 mg DDW 1 ml 称量配制均在EP管中操作。 平衡的酚： 经0.5 mol/L Tris·Cl pH8.0平衡，多次抽提，使其pH在7.8以上。（购买） NaAC（3 mol/L）：20 ml DDW 10 ml 无水乙酸钠 4.922 g 用冰乙酸调pH值至5.2，补DDW至20 ml，高压灭菌。 3M的醋酸钠有H2O分子的作用，促进DNA沉淀，PH4.8的醋酸钠溶液降低了反应混合物中的pH值，起到中和作用，从而染色体DNA或质粒复性，并聚集成不可溶的网络状聚合物。同时高浓度的醋酸钠亦会引起蛋白质-SDS复合物和高分子量的RNA分子发生沉淀。通过离心处理，便可把网络状的DNA聚合物同变性的蛋白质-DNA及RNA等以复合物形式沉淀出来，从而使.DNA得到纯化。 酚：氯仿：异戊醇：20 ml 平衡酚 10 ml 氯仿 9.6 ml