毕业论文开题报告-王晶.doc

开 题 报 告 Streptomyces thiolactonus?NRRL15439中负调控基因orf5670的发现和生物学功能研究通过实验研究发现在SthiolactonusNRRL15439里发现了一个负调控基因，异源表达及在原来宿主体内过表达发现能够抑制一些次级代谢产物的合成，主要是发现平板上色素合成被抑制住，同时我们对基因组进行分析发现，该基因位于一个可能的基因簇内部，设计在体内敲除该基因看能否激活基因簇的表达。 随着微生物基因组测序项目开展,越来越多的沉默基因簇被发现。采用激活微生物沉默基因簇的方法,可以充分发掘微生物次级代谢的潜力并可以获得大量新结构天然产物,为新药发现提供更多天然化合物来源, 能够产生众多具有生物活性的次级代谢产物,如目前广泛应用的抗生素、抗肿瘤药物以及免疫抑制剂等。在链霉菌中, 次级代谢产物的生物合成受到包括途径特异性、多效性以及全局性调控基因在内的多层次严格调控。关键调控基因的缺失或过表达可以显著影响次级代谢产物的生物合成, 提示对于链霉菌次级代谢重要调控基因的功能及其作用机制的研究具有巨大的潜在应用价值。 国内外关于该论题的研究现状和发展趋势 链霉菌的基因组大小多在数Mb以上, 如2001年完成测序的天蓝色链霉菌基因组大小为8, 667, 507bp, 2003年完成测序的阿维链霉菌基因组大小为9, 025, 608bp, 均大于所有的其它细菌基因组, 而其基因数量(约7000以上)与真核生物的酵母(6000)和人类(31000)相差不大, 这些都为链霉菌适应复杂多变的环境和其复杂的次生代谢调控提供了充足的遗传信息。次级代谢一般是在营养耗尽,生物合成或添加诱导物以及生长率下降的生理状态下起始。通常认为,营养降低等环境因素的变化先激活一个“总基因”,这个总基因或者作用于稀有tRNA 的转录,或者编码一个正调控的转录因子,既调控次级代谢又调控形态分化,被称为全局性调控,是较高级别的调控,如多效性调节基因bldA 和多效性作用因子A2因子、cAMP 和pp Gpp 。较低级别的调控控制次级代谢或形态分化的一个分支,主要发生在级联反应中的途径特异性转录激活子上,这些转录激活子又是多效性调节基因和作用因子的作用靶位点。 下面以抗生素合成的调控来介绍链霉菌次级代谢的调控机制及发展。 (1)途径专一性调控 由途径专一性调控因子作用的调控方式是抗生素调控中最常见的类型。例如:位于act基因簇中间的ActⅡ-ORF4,编码一个正调控因子调控部分或所有act合成基因的表达。ActⅡ-ORF4基因的突变,可以通过阻止act的转录,阻断所有其它水平的act突变株合成放线紫红素。有趣的是以低拷贝质粒为载体,额外增加一到两个拷贝的ActⅡ-ORF4就可以引起放线紫红素的高产。同样编码Red(十一烷基灵菌红素)生物合成途径专一性激活蛋白的redD基因也具有类似的功能。而且ActⅡ-ORF4和redD的产物氨基酸同源性非常高,所以它们可能是以相同的方式作用的。虽然在redD的N端附近可能有一个DNA结合区域,但是研究表明犷已已。的N端不会离那么远。因此仅根据ActⅡ-ORF4和RedD的氨基酸序列不能预测它们真正的功能将ActⅡ-ORF4引入波赛链霉菌同样能够刺激道诺霉素的高产。Dnrl和ActⅡ-ORF4功能的相似性可能与道诺霉素和放线紫红素具有相似结构有关。它们都是芳香族聚酮化合物,但是并不是所有的聚酮类抗生素都由ActⅡ-ORF4家族的某个成员调控的。例如:生二素链霉菌中的螺旋霉素是一种大环内酷类的聚酮化合物,它的调控基因srmR的产物还没发现同源物。 （2）AbsA、absB、abaA和afsB是否直接调控抗生素合成基因的表达呢?Northem杂交显示afsB突变至少在一定条件下可以刺激act产生少量的mRNA。将多拷贝的actⅡ-ORF4和redD基因引入absA和absB突变株,可以引起相应抗生素的高产,这说明 abs基因在抗生素合成基因的转录中起重要的作用,因为如果abs突变只是引起某种合成作用或代谢受限制的话,不会出现上述的情况。在abs突变株中不能合成放线紫红素或十一烷基灵菌红素的唯一原因也许只是不能产生足够有活性的ActⅡ一ORF4或RedD蛋白。另一种解释是:存在某种未知基因的产物在抗生素基因转录时与ActⅡ一ORF4或RedD相互作用,abs基因可能参与调控表达这个因子,而过量表达的ActⅡ一ORF4或RedD可以绕过对abs的依赖。 (3)双组份调控 双组份调控系统afsQ1-afsQ2和afsR-afsK是抗生素合成调控的另外一种方式。与absA一样afsQ1-afsQ2和afsR-afsK都是从天蓝色链霉菌中克隆到的,可以刺激变铅青链霉菌产生放线紫红素的基因,而它们对天