第39章基因工程及蛋白质工程.doc

第三十九章 基因工程及蛋白质工程 第一节 DNA 克隆的基本原理 基因克隆的技术路线大致包括以下几个程序：分离制备待克隆的DNA 片段（目的DNA）；在体外连接目的DNA 片段和载体；重组DNA 分子转入宿主细胞；筛选、鉴定阳性重组子；重组子的扩增。 一．DNA 限制酶与连接酶 类型Ⅰ限制酶为多亚基双功能酶，S 亚基为识别亚基，识别位点为两部分序列，中间有一定长度的任意碱基对，M 亚基有甲基化酶活性，R 亚基为切割亚基，可在识别位点1kb 以上处随机切割。 类型Ⅱ限制酶有两个相同的亚基组成，识别位点为4~6bp 的回文序列，切割位点在识别位点内，或靠近识别位点，经切割可以生成平头末端或粘性末端，可以产生相同粘性末端的不同的限制酶称作同尾酶。 类型Ⅱ限制酶是分子生物学中最重要的工具酶。 类型Ⅲ限制酶为两个亚基的双功能酶，M 亚基为识别亚基，R 亚基为切割亚基，切割位点在识别位点下游24~26bp 处，特异性不强。 EcoRI 与DNA 的复合体： 外源DNA 可以被插入质粒载体： 限制性内切酶切割DNA 形成对应的粘性末端： 使用相同的粘性末端进行重组，会有较多的载体自身环化，或目的基因串联，目的基因的定向连接常使用两种限制酶，产生两种不同的粘性末端。 可以在载体和目的基因的两端连接接头（引入限制酶切点），或衔接物（含有粘性末端），再连接载体和目的基因。 接头用于建立克隆片断的末端： 大肠杆菌的连接酶只能连接粘性末端，T4 连接酶可以连接平头末端，其条件是：提高T4 连接酶的浓度；提高DNA 片段的浓度；降低ATP 浓度；加入多胺类如亚精胺；加入浓缩剂如乙二醇。 T4 连接酶催化的反应： 二．分子克隆的载体与宿主系统 1．分子克隆的载体的基本条件 能自主复制；具有一种或多种限制性内切酶的单一切割位点，并在位点中插入外源基因后，不影响其复制功能；具有1-2 个筛选标记；克隆载体必须是安全的，不应含有对受体细胞有害的基因，并且不会任意转入其他生物细胞；易于操作，转化效率高。现用的载体都是通过改造构建而成的。宿主细胞的基本条件是：易于接受外源DNA；自身无限制酶和重组能力；易于生长和筛选；符合安全标准。 pBR322 是由几个质粒DNA 通过DNA 重组技术构建而成的克隆载体，分子的长度为4363bp。具有氨苄青霉素和四环素两种抗药性标记。pBR322 共有24 种限制性内切酶的单一识别位点，其中7 种酶(ecoRV,NheI,BamHI,sphI,salI,XmaⅢ,Nru I)的识别位点位于四环素抗性基因内部，2 种酶(ClaI,HindⅢ)的识别位点存在于这个基因的启动子内部。所以在这9 个限制性位点上插入外源DNA 通常都会导致抗四环素基因(tetr)的失活。3 种酶(scaI,PvuI,PstI)在氨苄青霉素抗性基因(ampr)内具单一的识别位点，在这3 个位点插入外源DNA 则会导致ampr 基因的失活。若将外源基因插入tetr 基因，将构成的重组质粒转入对四环素和氨苄青霉素均敏感的受体菌，则在含氨苄青霉素的平面培养基上生长，而在含四环素的平面培养基上不生长的菌落均含有外源基因。 20 世纪70 年代早期主要利用天然质粒，1977 年Bolivar 等构建成功pBR322、1982 年Viera 和Messsing构建成功pUC 系列质粒，随后有不少穿梭质粒，表达质粒等问世。 2．pUC 载体系列 是由大肠杆菌pBR322 质粒与M13 噬菌体改建而成的双链DNA 质粒载体，含有来自pBR322 质粒的复制起点(ori)，氨苄青霉素抗性基因(ampr)以及大肠杆菌a 半乳糖苷酶基因(lacZ)的启动子及其编码α肽链的基因，在lacZ 基因中有一个多克隆位点(MCS)区段。当外源的DNA 片段插入到这些克隆位点使á 互补链破坏时，形成的是无活性的a-半乳糖苷酶，被转化的大肠杆菌细胞，在Xgal-IPTG 培养基上形成白色菌落，而没有外源DNA 插入的质粒转化大肠杆菌细胞后，在Xgal-IPTG 培养基上形成蓝色菌落。pUC 质粒载体比pBR322 具有更小的相对分子质量，而且由于rop 基因的缺失(其基因产物ROP 蛋白，控制质粒复制)，使得其拷贝数大增，每个细胞可达500-700 个拷贝，因此由pUC 质粒重组体转化的大肠杆菌细胞，可获得高产量的克隆DNA 分子。pUC18 和pUC19 的唯一差别是多克隆位点的方 向相反。Xgal(5 溴-4-氯-3-吲哚-a-D-半乳糖苷)可被a-半乳糖苷酶水解生成深兰色的5-溴-4-靛兰，IPTG(异丙基硫代a-D-半乳糖苷)可诱导a-半乳糖苷酶á-链的合成。 适合于蓝白选择。 3．? 噬菌体 ? 噬菌体的基因组是长度约为50kb 的线性双莲DNA