TM-083细菌内毒素检查法程序.docVIP

细菌内毒素检查法起草人 审核人 审核人 批准人 部门 QC QA QC 质量管理部 姓名 饶涛 黄祥彪 汪大才 邓志军 签名日期分发部门： 质量管理部QC目的 建立细菌内毒素检查的标准操作程序,规范细菌内毒素的检验操作。 范围 细菌内毒素检查。 职责 QC 操作内容 4.1 4.1.1 本规范适用于细菌内毒素检查法——凝胶法。 4.1.2 鲎试剂灵敏度复核试验项的目的不仅是考察鲎试剂和细菌内毒素工作标准品的效价是否准确，也是考察检验人员操作方法是否正确和实验条件是否符合规定。因此要求每个实验室在将一批新的鲎试剂用于干扰试验或供试品细菌内毒素检查前应进行鲎试剂灵敏度复核试验。 4.1.3 供试品干扰试验项用于建立新品种细菌内毒素检查方法以及供试品的配方和工艺有变化，鲎试剂来源不同或供试品阳性对照结果呈阴性时确定供试品是否存在抑制或增强作用。 4.1.4 检查法项为供试品细菌内毒素检查方法，阴性对照、阳性对照和供试品阳性对照必须同时进行，否则试验结果无效。 4.2 实验材料及用具 4.2.1 电热干燥箱 除外源性内毒素用，温度应能维持250℃以上至少一小时。 4.2.2 试管恒温仪，精度在±0.2℃。在37℃±1℃保持一小时。 4.2.3 旋涡混合器 4.2.4 鲎试剂，应具有国家主管部门的批准文号。 4.2.5 细菌内毒素国家标准品(NSE)，细菌内毒素工作标准品(CSE)，除另有规定外应由中国药品生物制品检定所统一发放。 4.2.6 细菌内毒素检查用水(BET水) 系指与灵敏度为0.03EU/ml或更高灵敏度的鲎试剂在37±1℃条件下不产生凝集反应的灭菌注射用水。其内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水。 4.2.7 实验用具 移液管(或刻度吸管，定量移液器)、凝集管(10×75mm)、三角瓶、小试管(16×100 mm)、试管架、洗耳球、封口膜或金属试管帽、脱脂棉、吸水纸、剪刀、砂轮。所用玻璃器皿须经250℃干烤至少l小时。塑料用具应使用其它适宜的除细菌内毒素方法。 4.2.8 试剂 75%乙醇、蒸馏水、铬酸洗液。 4.3 操作方法 4.3.1 试验准备 4.3.1.1 洗液的配制 见“玻璃仪器的清洁标准操作规程” 4.3.1.2 玻璃器皿的洗涤将被洗涤的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并空干水分后，置洗液中浸泡4小时，取出将洗液滤干，用自来水将残余的洗液洗净，再用新鲜蒸馏水冲洗干燥后置适宜的密闭金属容器中，迅速置烤箱中。 4.3.1.3 除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素玻璃器皿置烤箱后将烤箱调至250℃，待烤箱温度升至设定的温度后开始记时，须干烤至少1小时。达到规定时间后，关断电源。待烤箱温度自然降至室温，在不开启金属容器的情况下，可在三天内使用，否则须再次加热除去可能存在的外源性内毒素。 4.3.2 鲎试剂灵敏度复核 在使用每一批新的鲎试剂 或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核实验。 4.3.2.1 内毒素标准溶液的制备 4.3.2.1.1 取CSE一支，轻弹瓶壁，使粉末落人瓶底，再用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，防止玻璃屑落入瓶内。 4.3.2.1.2 按标准品使用说明书用移液管加入规定量的BET水溶解其内容物，用封口膜将瓶口，封严。置旋涡混合器上混合15分钟，然后制备成所需浓度的细菌内毒素标准溶液即2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ(λ复核鲎试剂的标示灵敏度)，每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒(详细过程请参见使用说明书)。若为NSE，可按其使用说明书将其稀释至规定浓度后分装并保存。若为CSE，为一次性使用。 在上述稀释过程中，每稀释一步，均须在旋涡混合器上混合30秒钟。 4.3.2.2 待复核鲎试剂的准备 4.3.2.2.1 在制备内毒素标准溶液的同时，取0.1ml/支的鲎试剂18支轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底。用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%乙醇棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内，加入0.1mlBET水复溶，使内容物充分溶解，避免产生气泡。 4.3.2.2.2 若待复核鲎试剂的规格不是0.1ml/支时，按标示量加入BET水复溶，将复溶后的鲎试剂溶液混匀后每0.lml分配到10~75mm凝聚管中，要求至少分配18管备用。 4.3.2.3 加样 4.3.2.3.1 将已充分溶解的待复核鲎试剂18支(管)放在试管架上，排成5列，其中4支(管)4列分别加入2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的内毒素标准溶液；2支(管)l列分别加入BET水。内毒素标准溶液和BET水的加样量均为0.1ml/支。 4.3.2.4 加样结束后，轻轻混匀，避免产生气泡，放人37±1℃恒温器中，保温60±2分钟，观