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PCR (Polymerase Chain Reaction) 实验目的：熟悉PCR技术的基本原理和操作 实验背景 多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称ＰＣＲ技术，是８０年代中期发展起来的一种体外扩增特异ＤＮＡ片段的技术。此法操作简便， 可在短时间内在试管中获得数百万个特异的目的ＤＮＡ序列的拷贝，ＰＣＲ技术虽然问世仅数年时间， 但它已迅速渗透到分子生物学的各个领域，引起了生物技术发展的一次革命。 实验操作步骤 １. 在冰浴中，按以下次序将各成分加ＰＣＲ管中．(pPIC9-NGAL取1ul + 双蒸水19ul →定容至20ul)２×Ｔaq PCR MasterMix 5 μlpPIC9-NGAL (稀释后)1 μl引物Ｐ１１ μl引物Ｐ２１ μl双蒸水２ μl总体积１０ μl加好后，混匀，稍加离心并标记 ２．PCR反应条件 　　　95 ℃2min94 ℃3060 ℃30s72 ℃30s72 ℃5min ３．反应结束后取10μl用1.5%的琼脂糖电泳进行鉴定 电泳操作步骤（略） 参考“质粒DNA的提取和酶切鉴定”的电泳操处步骤 实验原理 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。 在待扩增的DNA片断两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。 PCR中的注意事项 PCR反应中可能出现的问题： 假阴性:不出现扩增条带 假阳性:空白对照出现目的扩增产物。原因：靶序列或扩增产物的交叉污染 出现非特异扩增带：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。原因：引物特异性差，模板、引物、Mg2+离子浓度过高，退火温度过低，及PCR循环次数过多。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增 出现片状拖带或涂抹带：PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。原因模板不纯，buffer不合适，dNTP、Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。 * *聚合酶链反应 PCR仪 电泳仪 琼脂糖凝胶电泳槽 凝胶成像系统 30个循环 maker 5 Essential Components of PCR Reaction Mg2+ dNTP Primers DNA Polymerase Template DNA 温度（℃） 时间（min） 94 72 60 94℃变性（30s） 60 ℃退火（30s） 72 ℃延伸（30s） 循环1循环2循环3 PCR反应的温度循环周期 94℃变性（30s） 1）PCR反应成分 （1）模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100?L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。 PCR反应条件 （2）引物浓度0.1-0.5 ?mol/L浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。 （3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)0.5-2.5 U/50 ?l酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。 （4）dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度四种dNTP浓度应相等浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。 （5） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。 TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCG ACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGC Step 1 : Denaturation 变性：在加热或碱性条件下可使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA。 TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGAT ACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTG