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关于探讨HBV DNA测定的影响因素 　　乙型肝炎病毒核酸（HBVDNA）的定量测定在乙型肝炎患者临床用药，治疗监测及判断预后具有重要意义。目前，HBV DNA测定方法主要用于荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR），该方法具有操作简单，定量范围宽，结果重复性好等优点。但因其敏感高，卫生部临检中心对方法中各个环节制定了规范性的要求，以消除除PCR本身外的外界影响因素。 　　1资料与方法 　　1.1试剂和仪器HBV DNA荧光定量PCR试剂盒及DN7600荧光定量PCR扩增仪均由广州中山大学达安基因公司提供。 　　1.2实验标本的选择均为临床确诊乙肝患者血清，HBV DNA的拷贝数104～108/ml。每份标本总胆红素、血脂均在正常范围内无溶血。 　　1.3溶血标本的制备将阳性血液离心后先取300ul作对照血清，然后将剩余血标本用无菌竹签搅拌，然后置-20℃冷冻10min，37℃水浴溶解后，4000 r/mon离心5mon，取400ul上清液备用；然后以上法继续对原标本进行搅拌、离心、冷冻。 　　1.4黄疸标本的制备取3种浓度不同的胆红素血清各180ml，与实验组20ul血清混合，其中每份吸取100ul用于HBV DNA定量测定，剩余100ul用于总胆红素测定。对照组用实验组血清20ul加入正常血清180ul，取100ul进行HBV DNA测定。 　　1.5脂血标本的制备将不同浓度脂血血清和正常血清加入到实验组和对照组，同时测定HBV DNA含量，实验组测定TG（甘油三酯）的含量。 　　1.6正常血清制备收集体检健康者血清，无黄疸、溶血和脂血。 　　以上黄疸、脂血、正常血清标本均经过HBV DNA检测，连续2次均为阳性。血红蛋白测定用迈瑞BC-5600血液分析仪测定，总胆红素含量用钒酸盐法，甘油三酯（TG）测定用酶法，其均在日立AU-2700全自动生化分析仪上进行检测。 　　1.7 HBV DNA测定取待测血清100 ul，加DNA浓缩液100 ul，12000 r/min离心10min后，弃掉上清液取沉淀，加20 ul DNA提取液后放入干式恒温器内100℃ 10 min，冷却后12000 r/min离心5 min，取上清液2 ul进行PCR扩增。每份标本测定3次，取3次结果均值作为测定值。 　　1.8统计学处理 将测定值换算成对数值，进行配对资料t检验。 　　2结果 　　2.1溶血标本对HBV DNA测定的影响我们用Hb含量（g/L）表示溶血程度，通过对未溶血血清与不同溶血程度血清HBV DNA测定，将拷贝数换算成对数值，进行配对资料t检验（t值为1.231），结果无显著性差异（P0.05）。 　　2.2胆红素对HBV DNA测定影响用T-BiL含量（umol/L）表示黄疸程度，正常血清T-BiL含量为2～20 umol/L。通过对正常血清与不同浓度总胆红素血清的HBV DNA测定，其拷贝数换算成对数值，进行配对资料t检验（t值为0.834），结果无显著性差异（P0.05）。 　　2.3血脂对HBV DNA测定影响脂血血清我们只讨论TG（血清甘油三酯）标本，用TG含量（mmol/L）表示，正常血清TG含量为0.34～1.71 mmol/L。 　　通过对正常血清TG与不同浓度TG血清的HBV DNA测定，其拷贝数经换算成对数值，进行配对资料t检验（t值为0.05），结果无显著差异（P0.05），见表1。 　　3讨论 　　影响PCR准确性因素很多，除PCP本身因素及反应体系外，标本本身也可能对HBV DNA检测结果产生影响，最常见情况有溶血、脂血和黄疸。实验表明，在Hb≤149 g/L，T-BiL≤145.3 umol/L，TG≤20.71 mmol/L范围范围内，高、中、低不同病毒载量标本的HBVDNA定量结果，均不受Hb、TG、T-BiL影响（P0.05）。 　　本实验中，对各种溶血不同程度HBV DNA阳性标本进行检测，其中结果与未溶血的标本无显著性差异。原因可能是在提取核酸前，已先用浓缩液经高速离心沉淀，HBV病毒颗粒并弃去上清，大大减少了干扰物质同时也减少了Hb的含量。还有一个原因是Hb经100℃10 min后，卟啉环已经被破坏，经过离心沉淀后，待测上清液中仅存其衍生物了。在脂血（这里主要讨论TG）检测中，HBV DNA荧光定量干扰机制主要是血液中低密度脂（乳糜微粒等）对荧光屏蔽和吸收作用。在实验中TG为20.71 mmol/L时，对检测结果也没有产生影响。原因可能是脂血中TG密度低，血清标本在冷冻或冷藏保存后，经高速冷冻离心，容易飘浮在上层，加之处理标本中多次稀释，干扰作用就变得很小。胆红素对实验的干扰主要在其本身的光吸收作用，但通过对不同浓度胆红素标本的HBV DNA测定，