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第三章 基因工程基本操作技术 第一节 离心技术 离心技术基本原理 离心机主要构造和类型 离心技术应用 生物样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离心力作用，使悬浮的微小颗粒(细胞器、生物大分子的沉淀等)以一定的速度沉降，从而与溶液得以分离。 沉降速度取决于颗粒的质量、大小和密度。 离心技术主要用于各种生物样品的分离和制备。 离心技术在生物科学，特别是在生物化学和分子生物学研究领域，己得到十分广泛的应用，每个生物化学和分子生物学实验室都要配置各种类型的离心机。 ∴ RCF = 1.119×10-5×(rpm)2r rpm---revolutions per minute为每分钟转数, r/min 低速离心时常以转速“rpm”来表示 高速离心时则以“g”表示 二、离心机的主要构造和类型 1、制备性离心机可分为三类 离心机一般有离心主机，转头和离心管三部分组成。 （1）普通离心机：最大转速6000rpm左右 （2）高速冷冻离心机：最大转速为20000～25000rpm（r/min） （3）超速离心机：转速可达50000～80000rpm，装有真空系统，这是它与高速离心机的主要区别。 分析性离心机 分析性离心机使用了特殊设计的转头和光学检测系统，以便连续地监测物质在一个离心场中的沉降过程，从而确定其物理性质。 2、转头 (1)角式转头 (2)水平转子 (3)区带转头： 区带转头无离心管，主要由一个转子桶和可旋开的顶盖组成。 (4)垂直转头： 其离心管是垂直放置的。 (5)连续流动转头： 转头与区带转头类似，由转子桶和有入口和出口的转头盖及附属装置组成。 3、离心管 塑料离心管常用材料有聚乙烯(PE)，聚碳酸酯(PC)，聚丙烯(PP)等，其中PP管性能较好。塑料离心管的优点是透明(或半透明)，硬度小，可用穿刺法取出梯度。缺点是易变形，抗有机溶剂腐蚀性差，使用寿命短。 不锈钢管强度大，不变形，能抗热，抗冻，抗化学腐蚀。但用时也应避免接触强腐蚀性的化学药品，如强酸、强碱等。 离心操作的注意事项 使用各种离心机时，必须事先在天平上精确 平衡离心管和其内容物，转头中绝对不能装 载单数的管子。当转头只是部分装载时，管子 必须互相对称地放在转头中，以便使负载均匀 地分布在转头的周围。 离心过程中不得随意离开。 就基因工程而言，核酸分子是其研究所涉及的主要对象，所以核酸的分离与提取是研究中很重要的基本技术。核酸样品的质量将直接关系到实验的成败。 核酸的分类 DNA :主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA（cpDNA），质粒DNA。 RNA :存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNA等。 除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。 一、核酸提取的基本原理 1、提取的含义: 提取是指在一定的条件下用一定的溶剂处理样品，使欲分离的物质充分释放到溶剂中的过程,又称为抽提。常用的溶剂有水、稀盐、稀酸、稀碱或甘油等较缓和的试剂。 2、影响提取的主要因素: (1)提取物质的结构与性质(与其溶解度有关)如:极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂，碱性物质易溶于酸性溶剂，两性电解质在pI时，溶解度最少。 (2)温度:一般温度升高溶解度增大 (3)溶液的粘度； (4)扩散速度； (5)扩散面积。 1. 核酸制备的一般原则 (1)分离纯化核酸总的原则： ①应保证核酸一级结构的完整性 ②排除其它分子的污染。 (2)核酸纯化应达到的要求： 核酸的纯化根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染,并除去提取过程中的系列试剂(盐、有机溶剂等）杂质，最后得到均一的核酸样品。 ①核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； ②其它生物大分子的污染应降低到最低程度； ③排除其它核酸分子的污染 2.核酸制备时应注意的事项: ①尽量简化操作步骤，缩短提取过程。 ②减少化学因素对核酸的降解。PH4-10 ③减少物理因素对核酸的降解。机械剪切力和高温 ④防止核酸的生物降解。 3.核酸制备的一般方法和原理 (1) 核酸酶的抑制和抑制剂剂 降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核