传代细胞培养.ppt

知识简介： 贴附生长型细胞 必须贴附于底物才能生长的细胞。大部分二倍体动物细胞。 悬浮生长型细胞 不需要附着于底物而于悬浮状态下即可生长。见于各种造血系统肿瘤细胞 培养基 天然培养基： 天然培养基有血清、血浆和组织提取液 优点：营养成分丰富，培养效果好 血清中含有： ①多种蛋白质（球蛋白、铁蛋白等） ②多种金属离子； ③激素； ④促贴附物质 ⑤各种生长因子 ⑥转移蛋白 ⑦不明成分 缺点： （1）来源受限。 （2）成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。 （3）易发生支原体污染 合成培养基 合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。 主要成分：氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。 优点：标准化生产，组分和含量相对固定，成本低 缺点：只能维持细胞不死，不能促进细胞增殖生长。使用时还要添加一定比例的天然培养基。例如血清。 一般说来，含5％小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死，但支持细胞生长一般需加 10％血清。 消毒 细胞培养的最大危险是发生培养物的细菌、真菌和病毒等微生物的污染 常见原因： 操作间或周围空间的不洁 培养器皿和培养液消毒不合格或不彻底 严格遵守操作常规，防止发生污染 传代细胞培养 一、目的要求 掌握动物细胞培养的基本原理。 掌握动物细胞传代培养的技术方法。 二、基本原理 细胞培养(cell culture) :即是把来自机体的组织经分散成为单个细胞，放在类似于体内的体外环境中生存，使其不断生长、繁殖或传代，借以观察细胞的生长、繁殖、衰老等生命现象。 可分为原代和传代培养两种方式。 原代培养 从体内取出细胞接种培养到第一次传代的阶段，叫原代培养。 方法：无菌操作取出组织（或器官） 酶消化处理 分散成单个细胞 培养使其不断地生长和繁殖。 动物细胞原代培养过程图 细胞系的生长过程 原代培养期 传代期 衰退期 为新鲜组织自体内取出并在体外培养生长至第一次传代的时期。 原代培养的细胞生长一定时间之后，贴附型细胞即融合成片而逐渐铺满底物的表面，便应将原代细胞分开接种至2个或更多的新的培养器皿中，即传代，此即成细胞系。 一般有限细胞系在此期的细胞开始时虽仍然存活，但增殖已很缓慢并逐渐完全停止，进而细胞发生衰退死亡。 传代细胞培养 原代培养的细胞在瓶壁相互汇合后，需要将其分开至多个新的培养瓶，叫传代。 否则因为接触抑制和密度抑制现象，引起细胞衰老，停止生长甚至死亡。 三、实验材料 用具器材： 移液枪，枪头、细胞培养瓶、倒置显微镜、酒精灯、液体储存瓶、试管架等。 实验药品：0.25％胰酶，D－Hanks，1640培养基。 实验材料 1、培养细胞生长的条件 细胞的营养需要 细胞的生存环境 温度: 37 ℃ O2 CO2: 5% pH: 7.2-7.4 渗透压 无毒 无污染 血清的成分 CO2培养箱设定的条件为37 ℃, 5％ CO2 。 使用时注意： ①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶 盖微松，以保证通气。 ②保持培养箱内空气干净。定期消毒 ③箱内加灭菌蒸馏水于槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。 细胞培养常用的培养瓶、培养皿、6孔板、96孔板 常用玻璃器皿清洗 在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感,均能影响培养细胞的生长 微生物产品附带杂物 上次细胞残留物 非营养成分的化学物质 浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小时）、流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50℃烘干 2、 293T细胞 293细胞是转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞系，293T细胞由293细胞派生，同时表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区的质粒可以复制。  实验中所用溶液的配制： D-Hanks工作液试剂配方 氯化钠 8g 磷酸氢二钠（Na2HPO4 ·12H2O） 0.132g 氯化钾 0.4g NaHCO3 0.35g D-葡萄糖 1g 0.1% 酚红液 1ml 三蒸水 800ml ，溶解后定容到1000ml。 113 ℃灭菌15min。 消化液：胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用D－hanks配置。 常用的浓度是0.25％ 。PH7.4用滤器过滤除菌。 培养基：1640培养基（含10%小牛血清） 四