第8章植物的细胞培养及次生物质生产..docVIP

第8章 植物的细胞培养及次生物质生产 第1节 单细胞培养技术 1 单细胞的分离 细胞来源:完整的植物器官、培养的组织通过物理的或酶处理的方法获得, 常用分散性较好的愈伤组织或悬浮培养物进行制备. 1.1 愈伤组织培养 选择外植体 ? 表面消毒 ? 接种 ? 培养 ? 继代培养 ?筛选疏松愈伤组织 1.2 单细胞的分离方法： 1）物理方法： 多次继代培养得到的疏松愈伤组织转入液体培养基: a 采用合适方法震荡使细胞分散; b 向细胞悬液中吹脉冲压缩空气； 过滤 c 在显微镜下用吸管吸取等。 2）化学方法： 加秋水仙碱；加草酸盐等；加2,4-D、CH等对分散细胞也有利。 3）酶处理： a)果胶酶；b)纤维素酶；c)葡萄糖苷酶和半乳糖苷酶等。 2 单细胞培养技术 2.1平板培养:将一定量的细胞接种到或混合到装有一薄层固体培养基的培养皿内进行培养的技术。 每个平板上新形成的细胞团数 植板率= ——————————————?100% 每个平板上接种的细胞数 注意事项: 最低起始细胞密度 在保证获得高的植板率的前提下,尽量使接种细胞的起始密度降低（条件培养基；有机成分）. 选用处于旺盛分裂期的细胞. 尽量减少细胞损伤. 在单细胞悬液和融化的琼脂培养基混合时,温度不应超过350 C. 最好置于黑暗或弱光下进行培养 2.2 条件培养 条件培养基： 已经进行过一段时间细胞悬浮培养的培养基。 制作方法: 配制悬浮细胞培养基?接种愈伤组织或悬浮细胞?培养?离心?上清液 固体条件培养基：上清液与加琼脂的灭菌培养基趁热充分混合. 2.3 看护培养和饲喂层技术 在活跃生长的愈伤组织上培养单细胞,并使之生长和增殖的方法叫看护培养。 用处理过的无活性的或分裂很慢、不具备分裂代谢能力的细胞来饲养所需培养的细胞，使其分裂和生长的方法叫饲喂层培养。 2.4 微室培养：是为了进行单细胞活体连续观察而建立的一种微量细胞培养技术。 微室技术要点： (1) 对微室的要求: 制作材料的光学性能要非常好； 小室的厚度要符合相差显微镜的要求; 选择合适的材料使小室与外界隔绝,应既能防止污染，又保证小室与外界能进行适当的气体交换. (2) 对培养基的要求: 选用的培养基要保证微室中的细胞能够生长和分裂,并应有较高的光学透明度. (3) 对所观察的细胞的要求: 选用生长旺盛,处于活跃分裂期并易于分散的细胞;细胞壁要较薄,细胞内含物要较少和透明度较高. 2.5 其他技术 液体浅层培养 将欲培养的分散细胞直接接入盛有浅层液体培养基的培养皿中进行培养。 微滴培养技术等：详见“原生质体培养” 第2节 植物细胞悬浮培养技术 将植物细胞和小的细胞团悬浮在液体培养基中进行培养的技术。细胞在培养过程中能保持较好的分散状态. (1)增加了细胞与培养液的接触面,改善了营养供应; (2)可避免有害代谢物在局部浓度过高; (3)有利氧的充分供应. 1 基本过程——以水稻细胞悬浮培养为例 1.1 愈伤组织培养 合适外植体 ↓消毒，25oC左右暗培养 愈伤组织 ↓约2周 继代培养 ↓ 筛选疏松愈伤组织 1.2 单细胞的分离 愈伤组织细胞计数 ↓ 单细胞的机械分离 ↓ 悬浮液的过滤 ↓ 单细胞的收集 ↓ 制成细胞悬液 1.3 单细胞悬浮培养 悬液细胞计数 ↓ 活细胞率测定 ↓ 悬浮培养 ↓ 细胞团和愈伤组织再形成 ↓ 转至分化培养基 ↓ 植株再生 2 培养工艺 2.1 分批培养 2.2 连续培养 （1）封闭式连续培养 新鲜培养液的注入和旧培养物的排出是平衡的。排出液中的细胞收集后仍加回培养系统中。 （2）开放式连续培养 新鲜培养基的加入和等体积的培养物的收获是平衡的. 这种平衡一般调节在使培养物能保持衡稳的、亚最大