原核表达及纯化结.docVIP

His标签重组蛋白大量表达及纯化 筛选及鉴定 将构建好的连接产物进行转化DH5α 鉴定 表达载体和目的片段的连接一般为10μL连接体系，此步转化方法如下： 取100μL DH5α感受态细胞，加入到10μL连接产物体系中 ↓ 冰上放置30min ↓ 42℃准确热激90秒 ↓ 冰上放置3min ↓ 加入300μL无Amp+ 的LB培养基，37℃ 100rpm/min振荡培养1h ↓ 将400μL菌液全部涂LB平板（含Amp+）水平放置30 min待菌液完全吸收后， 在37℃温箱中倒置培养过夜（12~16 h），直至出现单菌落。 2阳性克隆的PCR鉴定方法如下 挑取单菌落于200μL含Amp+LB培养基中（用2.0的离心管）摇床200rpm/min37℃培养4h待菌液浑浊后，取1μL做菌PCR鉴定PCR扩增体系如下： 取1 μL菌液作为模板 反应体系如下： 模板 1 μL 10×PCR反应缓冲液（含Mg2+ ） 2 μL dNTP(2.5 mmol/L/each) 1.6 μL 上游引物（10 μmol/L） 1 μL 下游引物（10 μmol/L） 1 μL Taq酶（5 U/μL） 0.3 μL ddH2O 13.1μL Total 20 μL 条件： 94℃预变性 10min 94℃变性 4